黄芪常用于治疗脑缺血损伤等中枢神经系统退行性疾病，黄芪甲苷Ⅳ (As Ⅳ)是从黄芪中提取的主要活性化合物之一，已被证实能通过血脑屏障并在脑实质中发挥作用^[1]。As Ⅳ可通过抑制促炎细胞因子的产生和激活中枢神经系统通路发挥抗炎作用。此外，黄芪甲苷还可通过增强肥胖大鼠下丘脑瘦素敏感性来改善机体代谢紊乱^[2]。本研究探讨黄芪甲苷改善炎症反应和瘦素抵抗性预防肥胖性高血压的作用机制，现报告如下。

1.   材料与方法

1.1   实验动物来源

雄性Wistar大鼠(35只, 日龄21 d)购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。所有动物均饲养在恒温室内(22±2)℃, 光照周期为12 h光照、12 h黑暗，可自由取食和饮水。实验动物生产许可证号为SCXK (京)2019-006, 实验动物使用许可证号为SYXK (京)2019-009。

1.2   试剂器材

As Ⅳ购自成都曼思特生物科技有限公司，试剂器材包块α7nAChR选择性拮抗剂α-BGT[(1 μg/(kg·d), Cat No. ab120542，Sigma)]、ALC-HTP系统(ALCBIO, China)、血糖仪(Freestyle, Abbott Diabetes Care, USA)、戊巴比妥(购自中国医药集团，生产批号F20081216); Au5400自动分析仪(奥林巴斯，日本)、血浆瘦素(Assay Biotech, Cat No.10638R)和胰岛素(Crystal Chem, Cat No. 90010)、Elisa试剂盒(购于北京四正柏生物科技有限公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司, Cat No. 15596-028)、Prime Script RT试剂盒(Takara BioInc，Lot No. RR047A)、LightCycler 480 Ⅱ RT-PCR系统(Roche)、BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime, China, Cat No. P0012S)、FluorChem Q 3.4(美国ProteinSimple)。同时还购入p-STAT3(Cat No. ab76315, Abcam, 1∶ 150 000)、p-PI3K (Cat No. ab182651, Abcam, 1∶ 500); α7nAchR (Cat No. ab10096, Abcam, 1∶ 500); p-IKKβ (Cat No. ab59195，Abcam，1∶ 1 000); NF-KB p65 (Cat No. 1075-1-ap，Proteomes，1: 500); TNF-α (Cat No. ab6617, Abcam, 1∶ 150); IL-6 (Cat No. sc-1265, Santa Cruz Biotechnology, 1∶ 500) 和β-actin (Cat No. ab6276, Abcam, 1∶ 5 000)。

1.3   分组与干预方法

正常饲养1周适应当前环境后将大鼠分为正常脂肪饲料组(NC组, n=10)和高脂肪饲料组(n=25)。正常脂肪类食物中含有蛋白质(20.25%)、脂肪(7.25%)和碳水化合物(62%), 高脂肪类食物中含有蛋白质(22%)、脂肪(27%)和碳水化合物(41%)。高脂肪饮食16周后，体质量比NC组高25%的则为肥胖大鼠。将18只肥胖大鼠随机分为3组: 对照组(n=6)、As Ⅳ组(n=6)和As Ⅳ+α-bungaratoxin(α-BGT)组(n=6)。As Ⅳ组和As Ⅳ+α-BGT组均给予As Ⅳ[20 mg/(kg·d)]。将As Ⅳ溶于1%的羧甲基纤维素溶液中，从第17周开始每日给予大鼠灌胃饮用，连续饮用6周^[3]。同时，对照组大鼠给予1 mL羧甲基纤维素溶液。此外, As Ⅳ+α-BGT组大鼠每天腹腔注射α7nAChR选择性拮抗剂α-BGT[1 μg/(kg·d)], 连续6周，其余各组以同样的方法分别给予等量生理盐水^[4]。

1.4   生理测量

记录各组每周的星期三至星期五7: 00—12: 00的血压、心率(HR)和体质量。采用耦合光电传感器测量收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和心率。将大鼠放入ALC-HTP系统，置于37 ℃ delta相热垫上扩张尾动脉。在使用ALC-HTP系统测量血压之前，所有的大鼠均经历自适应训练。将大鼠放入ALC-HTP系统后，在尾部放置尾袖光传感器，所有大鼠3 d内测量3次，取平均值。

1.5   收集下丘脑中下部和脂肪组织

22周后，采用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，处死收集组织。从腹主动脉采集血液进行进一步分析。血液中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和葡萄糖水平的测定使用au5400自动分析仪。采用开颅术将包含弓状核和腹内侧核的中下部下丘脑^[5]的脑组织取出，置于cold-Hank′s溶液中孵育3 min。收集后，将组织冷冻在液氮中，保存在-85 ℃下待进一步实验。切除附睾脂肪、腹膜后脂肪和肾周脂肪作为脂肪总重量，以体质量与脂肪的比值计算肥胖指数。附睾脂肪保存于-85 ℃, 以待进一步检测。

1.6   实验方法

葡萄糖耐量试验: 实验结束时，所有大鼠空腹过夜，腹腔注射葡萄糖(0.5 g/kg)进行糖耐量试验(GTT)。葡萄糖注射0、30、60和120 min后取尾静脉血样，使用血糖仪测定血糖浓度。

酶联免疫吸附试验(ELISA): 采用Elisa试剂盒检测血浆瘦素和胰岛素水平。胰岛素敏感性稳态模型评估(HOMA)计算公式: HOMA=空腹血糖(mmol/L)×空腹胰岛素(μU/mL)/22.5。采用相应的Elisa试剂盒测定血浆和肾皮质组织匀浆中去甲肾上腺素(NE)的含量以及附睾脂肪和血浆中白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR): 使用Trizol试剂在1 h内提取下丘脑中下部组织样本和附睾脂肪组织样本的总RNA。测定RNA含量，纯度按A260/A280比例测定，使用Prime Script RT试剂盒用于第一链互补DNA的逆转录，并按照制造商的说明进行操作。测定下丘脑组织中细胞因子信号抑制因子(SOCS3)、酪氨酸磷酸酶(PTP1B)、瘦素受体(LepRb)、皮质素原(POMC)和神经肽(NPY), 脂肪组织中α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)、核因子κB激酶亚单位β(IKKβ)、核因子κB抑制剂(NF-KB)。采用LightCycler 480 Ⅱ RT-PCR系统(Roche)进行RT-qPCR。所用引物如下。GAPDH-F: 5′-GGAAAGCTGTGGCGTGAT-3′, GAPDH-R: 5′-AAGGTGGAAGAATGGGAGTT-3′; LepRb-F: 5′-GAGAGGCTGCTGAAATCGTC-3′, LepRb-R: 5′-GACTCCTGAGCCATCCAGTC-3′; SOCS3-F: 5′-CTTTACCACCGACGGAACCT-3′, SOCS3-R: 5′-GAACTCCCGAATGGGTCCAG-3′; PTP1B-F: 5′-TTTCCACTACACCACCTGGC-3′, PTP1B-R: 5′-CACTGATCCTGCACTGACGA-3′; POMC-F: 5′-CATAGACGTGTGGAGCTGGTG-3′, POMC-R: 5′-TCAAGGGCTGTTCATCTCCG-3′; NPY-F: 5′-CTGACCCTCGCTCTATCCCT-3′, NPY-R: 5′-TGATGTAGTGTCGCAGAGCG-3′; 7nAchR-F: 5′-TCCCTCCAGGCATATTCAAG-3′, 7nAchR-R: 5′-CCAGTGACCACCCTCCATAG-3′; IKKβ-F: 5′-GGGACCCCGAGTTTTCATGT-3′, IKKβ-R: 5′-TCCTGTCGGCATTGCTTGAT-3′; NF-KB-F: 5′-ACTCTTACTCGCCTCCTTCT-3′, NF-KB-R: 5′-G TCTTCTTTCACCTCTGTGC-3′。PCR反应条件为: 95 ℃、10 min、40个循环, 95 ℃、15 s、60 ℃ 1 min。GAPDH作为mRNA表达的内参，每个样本检测3次，采用2^-△△Ct法计算表达情况。

Western Blot: 将冷冻组织在RIPA裂解缓冲液中裂解。匀浆4 ℃孵育30 min, 于4 ℃、15 000 g离心15 min。采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。将30 μg样品在10% SDS-PAGE上进行电泳分离，并转移到硝酸纤维素(PVDF)膜上。PVDF膜与一抗孵育，再与相应的二抗孵育。使用的抗体如下: p-STAT3、p-PI3K、α7nAchR、p-IKKβ、NF-KB p65、TNF-α、IL-6和β-actin; 然后，用相应的二抗孵育膜。使用FluorChem Q 3.4(美国ProteinSimple)分析条带密度, β-actin作为蛋白表达的内参。

1.7   统计学分析

数据分析采用SPSS 21.0 (New York, USA)和GraphPad Prism version 7.0(California, USA)进行处理，计量资料以( ±s)表示，采用t检验或one-way ANOVA, 检验水准为α=0.05, 双尾检验, P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   As Ⅳ对肥胖大鼠体质量和糖脂代谢水平的影响

饲养16周后，对照组大鼠平均体质量高于NC组，差异有统计学意义(P＜0.05); 测量葡萄糖耐量、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、TC和TG水平以评估As Ⅳ对糖脂代谢的作用。与NC组相比，对照组30、60、120 min血糖水平、HOMA-IR、TC、TG水平均升高，差异有统计学意义(Pv0.05); 与对照组相比, As Ⅳ组干预后葡萄糖不耐受和HOMA-IR指数改善, TC和TG水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05); As Ⅳ+α-BGT组干预后As Ⅳ的作用减弱，与As Ⅳ相比，在30、60和120 min时，大鼠的血糖、HOMA-IR指数、TC和TG水平提高，差异有统计学意义(P＜0.05), 见图 1。

图  1  As Ⅳ对肥胖大鼠体质量和糖脂代谢水平的影响

A: 饲养16周后，各组大鼠平均体质量变化情况; B: 各组血糖水平变化情况; C: 各组HOMA-IR变化情况; D: 各组TC水平变化情况; E: 各组TG水平变化情况。与NC组比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05; 与As Ⅳ+α-BGT组比较, △P＜0.05。

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2.2   As Ⅳ对肥胖大鼠交感神经传导的血压影响

连续干预6周后，对照组大鼠SBP和DBP水平升高，As Ⅳ组SBP和DBP水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05); 测定血浆和肾组织中NE的含量以评估周围交感神经的活性。与NC组相比，对照组血浆和肾脏组织中NE的含量升高，与对照组和As Ⅳ+α-BGT组相比, NE的含量降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 见图 2。

图  2  As Ⅳ对肥胖大鼠交感神经传导的血压的影响

A: 连续干预6周后，各组大鼠SBP水平变化情况; B: 各组大鼠DBP水平变化情况; C: 连续干预6周后，各组大鼠血浆中NE的含量比较; D: 各组大鼠肾组织中NE的含量比较。与NC组比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05; 与As Ⅳ+α-BGT组比较, △P＜0.05。

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2.3   As Ⅳ调节下丘脑瘦素信号通路和食欲相关肽基因表达

肥胖大鼠脑中枢瘦素抵抗常导致交感神经兴奋增加。与NC组相比，对照组大鼠血浆瘦素水平升高, LepRb mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。此外，瘦素信号分子p-STAT3的表达下降，而p-PI3K、SOCS3 mRNA和PTP1B mRNA的表达增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。

As Ⅳ干预后逆转了这一现象，但在As Ⅳ+α-BGT组中, As Ⅳ对瘦素抵抗性的影响减弱。瘦素通过激活JAK2/STAT3通路调控食欲相关肽包括POMC和NPY的表达，与对照组和As Ⅳ+α-BGT组相比，As Ⅳ组POMC mRNA水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05), NPY mRNA水平无明显变化。见图 3。

图  3  As Ⅳ调节下丘脑瘦素信号通路和食欲相关肽基因表达

A: 各组大鼠血浆瘦素水平; B: 各组大鼠血浆LepRb mRAN表达水平; C: 各组大鼠血浆p-STAT3、p-PI3K蛋白表达水平; D: 各组大鼠血浆SOCS3 mRNA表达水平; E: 各组大鼠血浆PTP1B mRNA的表达水平; F: 各组大鼠血浆POMC mRNA水平; F: 各组大鼠血浆PTP1B mRNA的表达水平; F: 各组大鼠血浆NPY mRNA水平。与NC组比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05; 与As Ⅳ+α-BGT组比较, △P＜0.05。

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2.4   As Ⅳ通过激活α7nAChR的表达抑制下丘脑炎症反应

为确定As Ⅳ干预可能挽救下丘脑瘦素信号的机制，本研究评估了As Ⅳ对与瘦素信号中断和胆碱能抗炎通路活性相关局部炎症的影响。结果表明，与NC组比较，对照组α7nAChR蛋白和α7nAChR mRNA的表达水平均下降，而p-IKKβ、NF-KB蛋白及其mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05); 炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达水平增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较, As Ⅳ组α7nAChR蛋白和mRNA表达升高, p-IKKβ、NF-KB蛋白及其mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。与As Ⅳ组比较, α7nAChR阻断剂α-BGT降低了As Ⅳ组α7nAChR mRNA和蛋白表达水平, IKKβ mRNA、NF-KB mRNA、p-IKKβ、NF-KB、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义(P＜0.05), 见图 4。

图  4  As Ⅳ激活α7nAChR的表达抑制下丘脑炎症反应

A: 各组下丘脑中α7nAChR蛋白和mRNA、p-IKKβ、NF-KB蛋白及mRNA表达水平; B: 各组下丘脑中IL-1β和TNF-α蛋白表达水平。与NC组比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05; 与As Ⅳ+α-BGT比较, △P＜0.05。

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2.5   As Ⅳ通过激活脂肪组织中的α7nAChR表达来减轻炎症反应

As Ⅳ是否能通过激活肥胖大鼠脂肪组织中α7nAChR通路来减轻外周炎症的检测结果表明，与NC组比较，对照组α7nAChR mRNA表达水平下降，而p-IKKβ、NF-KB mRNA表达升高，血浆和脂肪组织中的IL-1β和TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与对照组和As Ⅳ+α-BGT组比较, As Ⅳ组α7nAChR mRNA表达升高, p-IKKβ、NF-KB、IL-1β、TNF-α表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05), 见图 5。

图  5  As Ⅳ通过激活脂肪组织中的α7nAChR表达来减轻炎症反应

A: 各组脂肪组织中α7nAChR mRNA表达水平; B: 各组脂肪组织中p-IKKβ mRNA表达水平; C: 各组脂肪组织中NF-KB mRNA表达水平; D: 各组脂肪组织中IL-1β水平; E: 各组脂肪组织中TNF-α水平; F: 各组血浆中IL-1β水平; G: 各组血浆中TNF-α水平。与NC组比较, *P＜0.05; 与对照组比较, #P＜0.05; 与As Ⅳ+α-BGT比较, △P＜0.05。

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3.   讨论

肥胖相关高血压与中枢和外周炎症密切相关，随着肥胖的发展，外周组织中产生的促炎细胞因子可以反馈到大脑，强化和维持下丘脑炎症。目前已有药物存在依赖性，并出现停药后反弹等临床副作用。研究^[6]指出，尼古丁通过抑制IKKβ/NF-KB信号转导通路的激活，并与免疫细胞中的α7烟碱乙酰胆碱受体(α7nAChR)结合，从而减少促炎细胞因子的产生。研究^[7]表明，尼古丁诱导α7nAChR激活可通过阻断IKKβ/NF-KB通路显著缓解外周炎症，有助于改善肥胖大鼠的瘦素抵抗和代谢功能障碍。近年来，多项研究^[8]表明，一些天然生物活性化合物如As Ⅳ、原花青素和人参皂苷Rb1是治疗肥胖和肥胖相关炎症的潜在药物。本研究结果表明, As Ⅳ可以抑制中枢和外周炎症反应，改善瘦素抵抗，从而防止肥胖相关高血压的发展，主要通过增加下丘脑和脂肪组织中α7nAChR的表达起作用。本研究发现, As Ⅳ治疗可减少大鼠体质量，改善糖脂代谢水平，这与文献^[9]报道的结果一致。然而，当As Ⅳ与α7nAchR拮抗剂α-BGT同时干预时，上述作用均明显减弱，表明As Ⅳ所表现出的改善作用与α7nAchR激活有关。

瘦素抵抗在肥胖、交感神经过度兴奋和肥胖相关高血压之间起到重要的作用^[10]。瘦素通常与神经元中的受体LepR结合，激活JAK2/STAT3信号通路，通过刺激厌食神经肽包括(POMC)的转录和抑制orexigenic NPY/agouti基因相关蛋白(AgRP)的转录来抑制食欲^[11]。在肥胖患者中，过量的瘦素并不能有效调节食欲和能量消耗，但能够对交感神经产生刺激作用，导致HR和血压升高^[12]。目前，尽管尚未完全了解瘦素抵抗的确切机制，但下丘脑神经元中瘦素表达减少和细胞内瘦素转导信号中断被认为是瘦素抵抗的重要潜在机制。STAT3信号参与交感神经介导的代谢活动，但不影响肾脏交感神经活动，瘦素诱导的下丘脑神经元中STAT3磷酸化水平的降低被认为是肥胖大鼠瘦素信号衰减的主要标志^[13]。与STAT3信号通路相比，下丘脑神经元中激活的PI3K信号通路在瘦素诱导的肾交感神经活动和血压升高中起关键作用^[14]。因此，肥胖患者中下丘脑神经元中抑制的STAT3信号转导和升高的PI3K信号转导是下丘脑瘦素抵抗最重要的机制之一，常导致代谢障碍和交感神经介导的高血压。本研究中，肥胖大鼠血浆瘦素水平升高，下丘脑LepRb mRNA表达降低，同时，下丘脑组织中p-STAT3表达降低, p-PI3K相对升高，提示肥胖大鼠出现瘦素抵抗。同样，肥胖大鼠的血压和NE含量也明显增加。As Ⅳ干预可明显改善下丘脑神经元的瘦素信号通路，上调LepRb和p-STAT3的表达，下调p-PI3K的表达，进而改善肥胖大鼠的瘦素敏感性。

瘦素诱导的POMC-黑皮质酮系统激活(瘦素激活JAK2/STAT3通路，促进POMC肽的产生，激活黑皮质酮受体，介导外周交感神经流出)是肥胖相关高血压的主要病理机制^[15]。本研究发现，肥胖诱导的高血压大鼠的POMC mRNA表达下降，而As Ⅳ治疗提高了POMC的表达，但未增高血压。慢性肥胖导致外周脂肪组织和下丘脑IKKβ/NF-KB通路的激活，这是导致瘦素抵抗的最重要的潜在机制之一。本研究中肥胖大鼠下丘脑和脂肪组织中、NF-KB和促炎因子表达明显增加，下丘脑中SOCS3和PTP1B同样过表达。胆碱能抗炎通路表明, α7nAchR通过抑制中枢和外周组织IKKβ/NF-KB通路的激活而抑制炎症反应。因此，在中枢和外周组织中上调或激活α7nAchR可能是通过抑制炎症反应来阻断瘦素抵抗的有效途径。本研究结果证实了这一假说，高脂诱导的肥胖大鼠中下丘脑和脂肪组织中α7nAchR的表达降低, As Ⅳ干预能够使α7nAchR的表达上调，抑制IKKβ/NF-KB通路的激活，通过降低SOCS3和PTP1B的表达来阻止下丘脑瘦素抵抗的发展。通过靶向α7nAchR抑制下丘脑IKKβ/NF-KB通路激活是预防肥胖相关高血压发生、发展的关键通路，也是As Ⅳ预防肥胖相关高血压发生的关键机制。虽然本研究尚未探讨这一现象的分子机制，但推测可能与胆碱能神经系统的调节有关。

综上所述, As Ⅳ可通过改善炎症反应和瘦素抵抗来降低肥胖相关高血压，这与下丘脑和脂肪组织中α7nAchR的表达上调密切相关。As Ⅳ有望为防治肥胖相关高血压提供一种新的选择。