Effect of silencing E26 transformation-specific sequence 4 on proliferation and migration of colon cancer cells by inhibiting nuclear factor-κB signaling pathway
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摘要:目的
探讨E26转录因子变异体4(ETV4)通过核因子-κB(NF-κB)信号通路对结肠癌细胞增殖和迁移的影响机制。
方法通过用户友好的交互式癌症转录组数据分析资源(UALCAN)数据库分析ETV4在结肠正常组织和癌组织中的表达; 采用逆转录定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和Western blot检测ETV4在正常肠上皮细胞和结肠癌细胞系中的表达; 沉默SW480细胞的ETV4后, 采用qRT-PCR和Western blot检测ETV4的表达以评估转染效率; 采用菌落形成实验和Transwell实验检测沉默ETV4后对结肠癌细胞增殖和迁移的影响; 采用Western blot检测沉默ETV4后对NF-κB通路中的蛋白65(p65)和磷酸化蛋白65(p-p65)的蛋白表达的影响。
结果UALCAN数据库分析结果显示ETV4在结肠癌组织中高表达。qRT-PCR和Western blot检测显示ETV4在结肠癌细胞系SW480、Lovo、Caco-2和SW620中的表达高于正常肠上皮细胞HIEC-6, 其中SW480细胞中ETV4的表达最高，差异有统计学意义(P < 0.001)。菌落形成实验和Transwell实验结果显示，沉默ETV4后显著抑制了结肠癌细胞SW480的增殖和迁移能力(P < 0.001)。Western blot检测结果显示，沉默ETV4显著抑制细胞中p-p65蛋白的表达(P < 0.001)。
结论沉默ETV4可能抑制NF-κB信号通路的激活，进而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。
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关键词:
- E26转录因子变异体4 /
- 核因子-κB /
- 结肠癌 /
- 细胞增殖 /
- 细胞迁移
Abstract:ObjectiveTo investigate the mechanism of E26 transformation-specific sequence 4 (ETV4) affecting the proliferation and migration of colon cancer cells through the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway.
MethodsThe expression level of ETV4 in normal colon tissues and cancer tissues was analyzed by the user-friendly interactive cancer transcriptome data analysis resource (UALCAN) database. Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression level of ETV4 in normal intestinal epithelial cells and colon cancer cell lines. After silencing ETV4 in SW480 cells, qRT-PCR and Western blot were performed to detect the expression of ETV4 to assess transfection efficiency; colony formation and Transwell assays were conducted to explore the effects of ETV4 silencing on the proliferation and migration of colon cancer cells; the Western blot was used to detect the effects of ETV4 silencing on the protein expression of protein 65 (p65) and phosphorylated protein 65 (p-p65) in the NF-κB pathway.
ResultsThe UALCAN database analysis revealed high expression of ETV4 in colon cancer tissues. The qRT-PCR and Western blot showed that ETV4 expression was significantly higher in the colon cancer cell lines SW480, Lovo, Caco-2, and SW620 than in normal intestinal epithelial cells HIEC-6, with the highest expression in SW480 cells (P < 0.001). Colony formation and Transwell assay results indicated that silencing ETV4 significantly inhibited the proliferation and migration of colon cancer SW480 cells (P < 0.001). Western blot results showed that silencing ETV4 significantly inhibited the expression of p-p65 protein in the cells (P < 0.001).
ConclusionSilencing ETV4 may inhibit the activation of the NF-κB signaling pathway, thereby inhibiting the proliferation and migration of colon cancer cells.
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结肠癌是一种常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病具有年轻化趋势，全球死亡率很高[1-2]。结肠癌早期症状不明显，只有少数患者被诊断为局部晚期结肠癌且发病隐匿，大多数患者预后不良[3-4]。结肠癌的高复发率和远处转移的特点导致患者的5年生存率较低[5]。因此，深入研究结肠癌的发病机制，寻找早期诊断和预后判断的标志物尤为重要[3]。E26转录因子变异体4(ETV4)是一种转录因子，属于E26转化特异性家族，在多种恶性肿瘤发病中起关键作用[6-7]。例如, ETV4通过激活CXC族趋化因子配体13/CXC族趋化因子受体5(CXCL13/CXCR5)信号传导加剧胰腺导管腺癌的转移[8]; ETV4通过介导赖氨酸脱甲基酶5D(KDM5D)基因控制胃癌的恶性进展[9]; 研究[10-11]报道ETV4在结肠癌组织中高表达，并与结肠癌的恶性发展有关。研究[12]表明核因子-κB(NF-κB)信号通路在结肠癌增殖、迁移和血管形成等肿瘤恶性行为过程中发挥重要作用。例如，TNF受体关联因子5(TRAF5)通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/核因子κB (PI3K/AKT/NF-κB)信号通路促进结肠癌的发生和发展[13]。本研究基于NF-κB信号通路探讨ETV4对结肠癌增殖和迁移的作用机制，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 材料及细胞株
正常结肠上皮细胞HIEC-6和结肠癌细胞系SW480、Lovo、Caco-2、SW620均购自中国科学院细胞库; TRIZOL试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher; 抗体β-actin、p-p65、和p65购自Abcam公司，抗体ETV4购自武汉华美生物工程有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及转染
将细胞置于含胎牛血清和霉菌素的培养液中，适宜环境下培养。待细胞生长良好并密集后，进行质粒转染。转染前，将质粒与培养基混合，并在培养箱中孵育，随后加入孔板中，转染数小时后更换液体。将细胞分为sh-NC组和sh-ETV4组。
1.2.2 逆转录定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测mRNA水平
采用TRIZOL试剂盒提取总RNA, 使用逆转录试剂盒依据说明书合成cDNA, 利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和基因特异性引物的qRT-PCR检测RNA表达。采用2-ΔΔCT方法计算相对mRNA的表达。
1.2.3 Western blot检测蛋白表达
提取总蛋白并使用BCA定量方法检测蛋白浓度，然后加入抗体孵育, ECL试剂化学发光、显色，采用Image J分析，每组重复3次。
1.2.4 菌落形成实验
将细胞(1×103个细胞/孔) 接种于6孔板中, 37 ℃培养12 d后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗, 4%甲醛固定后, 1.0%结晶紫过夜培养。对形成的含有50个以上细胞的克隆进行人工计数。
1.2.5 Transwell细胞侵袭实验
将细胞培养24 h, 对照细胞加入等体积PBS，每组重复3次, 4×104/孔，将细胞接种于含2% FBS的上室，下室加入含10% FBS的培养基500 mL, 孵育24 h, 去除上室细胞，采用4%多聚甲醛固定，最后使用结晶紫染色，洗涤后干燥并计数。
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析，数据采用(x±s)表示，多组间比较先进行方差齐性检验，若满足方差齐性则采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验; 若不符合方差齐性检验，则采用Kruskal-Wallis检验进行分析，两组间比较采用Dunn′s-Test。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 ETV4在结肠癌中高表达
用户友好的交互式癌症转录组数据分析资源(UALCAN)数据库结果显示, ETV4在结肠癌组织中的表达高于正常结肠组织; 通过qRT-PCR和Western blot检测发现, ETV4在4种结肠癌细胞(SW480、Lovo、Caco-2、SW620)中的表达高于正常肠上皮细胞，且ETV4在SW480细胞中的相对表达最高，差异有统计学意义(P < 0.001)。见图 1、表 1。
表 1 各细胞中 ETV4 mRNA和ETV4蛋白相对表达(x±s)细胞 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 HIEC-6 1.00±0.15 0.26±0.03 SW480 3.22±0.36*** 0.95±0.08*** Lovo 2.64±0.19*** 0.59±0.07*** Caco-2 1.67±0.15* 0.42±0.04* SW620 2.44±0.14*** 0.51±0.06** ETV4: E26转录因子变异体4。
与HIEC-6比较, * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.0012.2 ETV4的转染效率
采用qRT-PCR和Western检测发现，与sh-NC组比较, sh-ETV4组 ETV4 mRNA和ETV4蛋白水平均降低，差异有统计学意义(P < 0.001)。见图 2、表 2。
表 2 sh-NC组与sh-ETV4组 ETV4 mRNA和ETV4蛋白表达比较(x±s)组别 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 sh-NC组 1.00±0.11 0.84±0.07 sh-ETV4组 0.38±0.04*** 0.28±0.04*** 与sh-NC组比较, * * * P < 0.001。 2.3 菌落形成实验及Transwell实验结果
菌落形成实验结果显示, sh-ETV4组菌落形成数目为(73.00±6.00), 低于sh-NC组的(151.00±11.00), 差异有统计学意义(P < 0.001)。见图 3。Transwell实验结果显示, sh-ETV4组细胞迁移数目为(184.00±12.00), 低于sh-NC组的(354.00±32.00), 差异有统计学意义(P < 0.001)。见图 4。
2.4 ETV4对NF-κB信号通路的影响
采用Western blot实验检测NF-κB通路蛋白65(p65)、磷酸化蛋白65(p-p65)的蛋白表达, sh-ETV4组p-p65与p65蛋白表达比值(p-p65/p65)为(0.67±0.06), 低于sh-NC组的(1.23±0.11), 差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 5。
3. 讨论
结肠癌是世界范围内致死率排名第2位的癌症[14-15]。结肠癌的早期诊断较为困难，导致大多数患者在中晚期才能诊断并接受治疗，进而导致预后较差[16]。近年来，结肠癌的发病率和致死率有升高趋势[17]，探寻新的分子机制对诊断和治疗结肠癌具有重要的研究价值。
本研究通过UALCAN数据库发现ETV4在结肠癌中高表达。ETV4属于ETS转录因子家族，该家族是进化上保守且最大的转录因子家族之一[6]。研究[18]显示ETV4的异常表达在多种恶性肿瘤的发病机制中起着关键作用，包括乳腺癌、肺癌、胃癌和肝细胞癌。在肝癌中, ETV4通过激活肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和丝裂原激活蛋白激酶11(MAPK11)的转录，促进肝脏炎症和肿瘤的发生; ETV4在多种肿瘤细胞迁移和增殖中发挥作用, ETV4在多种结肠癌细胞中高表达，沉默ETV4后显著降低了结肠癌细胞的增殖和迁移，提示ETV4在结肠癌中发挥促癌作用。
NF-κB信号通路在癌症的发生和发展中发挥重要作用。NF-κB信号通路由Nfκb1、Nfκb2、Rela(p65)、c-Rel和Relb组成[19]。作为NF-κB家族的一员, p65在非诱导状态下主要位于细胞质中[20]。既往研究[21]发现, p65在多种癌症类型中高表达，可以转录激活下游基因来发挥各种功能，包括调节细胞增殖、凋亡和免疫。NF-κB p65亚基的翻译后修饰为多种癌症类型中差异调节NF-κB信号活性提供了重要机制[22]。例如, FBXW2对NF-κB p65的泛素化可抑制乳腺癌干细胞特性、肿瘤发生和紫杉醇耐药性[22]。MRTF-A-NF-κB/p65轴介导的程序性死亡配体1(PD-L1)转录和表达通过肿瘤坏死因子-β(TGF-β)促进非小细胞肺癌的免疫逃避[23]。NF-κB/miR-1262/FGFR1轴可调节结肠癌细胞表型，包括增殖、侵袭和迁移[12]。本研究结果发现，沉默ETV4后, NF-κB信号通路中p-p65蛋白表达降低，说明ETV4可能是通过NF-κB通路来发挥促癌效果。
综上所述, ETV4在结肠癌细胞中高表达，沉默ETV4可能通过抑制NF-κB信号通路的激活，进而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。
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表 1 各细胞中 ETV4 mRNA和ETV4蛋白相对表达(x±s)
细胞 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 HIEC-6 1.00±0.15 0.26±0.03 SW480 3.22±0.36*** 0.95±0.08*** Lovo 2.64±0.19*** 0.59±0.07*** Caco-2 1.67±0.15* 0.42±0.04* SW620 2.44±0.14*** 0.51±0.06** ETV4: E26转录因子变异体4。
与HIEC-6比较, * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001
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表 2 sh-NC组与sh-ETV4组 ETV4 mRNA和ETV4蛋白表达比较(x±s)
组别 ETV4 mRNA相对表达 ETV4蛋白相对表达 sh-NC组 1.00±0.11 0.84±0.07 sh-ETV4组 0.38±0.04*** 0.28±0.04*** 与sh-NC组比较, * * * P < 0.001。
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