Awakening effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation combined with multi-sensory environmental stimulation in patients with persistent vegetative state
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摘要:目的
分析经皮耳迷走神经电刺激(taVNS)联合多感官情景刺激对持续性植物状态(PVS)患者的促醒效果。
方法选取60例PVS患者为研究对象，并随机分为对照组(n=30)和观察组(n=30)。对照组脱落3例，最终纳入27例，观察组脱落2例，最终纳入28例。2组均给予基础治疗及常规康复训练。观察组采用多感官情景刺激联合taVNS治疗，对照组采用多感官情景刺激联合假刺激治疗。2组治疗频率均为1次/d, 5次/周，连续治疗8周。比较2组患者治疗前，治疗4、8周后，以及随访时(12周)的格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分、改良国际昏迷恢复量表(CRS-R)评分。分析2组治疗前、治疗8周后的脑电图(EEG)分级情况。比较2组随访时的促醒效果。
结果治疗4、8周后以及随访时, 2组患者的GCS、CRS-R评分高于治疗前，且观察组高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。治疗8周后, 2组患者EEG分级优于治疗前，且观察组优于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。随访时，观察组促醒率为46.43%, 高于对照组的29.63%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论taVNS联合多感官情景刺激对PVS患者的促醒作用较好，可改善其意识障碍水平，且安全性较高。
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关键词:
- 持续性植物状态 /
- 经皮耳迷走神经电刺激 /
- 多感官情景刺激 /
- 促醒 /
- 意识障碍
Abstract:ObjectiveTo analyze the awakening effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation (taVNS) combined with multi-sensory environmental stimulation in patients with persistent vegetative state (PVS).
MethodsSixty PVS patients were selected as study subjects, and randomly divided into control group (n=30) and observation group (n=30). Three patients in the control group shed 3 cases and eventually included 27 cases, and the observation group shed 2 cases and eventually included 28 cases. Both groups received basic treatment and routine rehabilitation training. The observation group was treated with multi-sensory environmental stimulation combined with taVNS, while the control group received multi-sensory environmental stimulation combined with sham stimulation. Both groups were treated once per day, five times per week, for eight consecutive weeks. The Glasgow Coma Scale (GCS) and the Coma Recovery Scale-Revised (CRS-R) scores were compared between the two groups before treatment, after 4, 8 weeks of treatment and during follow-up (12 weeks). The electroencephalogram (EEG) grading was analyzed before and after 8 weeks of treatment. The awakening effect during follow-up was compared between the two groups.
ResultsAfter 4, 8 weeks of treatment and during follow-up, the GCS and CRS-R scores of both groups were significantly higher than before treatment, and the observation group had significantly higher scores than the control group (P < 0.05). After 8 weeks of treatment, the EEG grading of both groups was significantly better than before treatment, and the observation group was significantly better than the control group (P < 0.05). During follow-up, the awakening rate in the observation group was 46.43%, which was significantly higher than 29.63% in the control group (P < 0.05).
ConclusionThe method of taVNS combined with multi-sensory environmental stimulation has a good awakening effect in PVS patients, and can improve their level of consciousness disorder with high safety.
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结直肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在各种恶性肿瘤中分别位居第3位和第2位[1]。目前针对结直肠癌的治疗取得了较大进展，但患者的5年生存率仍不足40%[2]。肿瘤细胞即使在有氧条件下也倾向于通过糖酵解途径来获取能量，这一现象被称为“Warburg效应”[3]。有氧糖酵解参与能量的快速合成、肿瘤微环境的改变和细胞信号通路的激活[4]。由基因肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)编码的6-磷酸果糖激酶1(PFK1)在糖酵解途径中发挥重要作用。相关文献[5]显示下调PFK1抑制鼻咽癌的增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡，但PFK1在结直肠癌中的研究鲜有报道。
N6-甲基腺苷(m6A)修饰受三类调节因子调控，包括甲基化酶、去甲基酶和m6A阅读蛋白[6]。决定m6A修饰命运的是m6A阅读蛋白，其可以识别并与含有m6A的RNA相互作用，调节其功能[7]。m6A阅读蛋白人类抗原R(HuR) 是一种胚胎致死性视觉异常RNA结合蛋白，由基因ELAV样蛋白1 ( ELAVL1 )所编码，可通过识别并结合靶基因上的m6A修饰位点增强mRNA稳定性[8]。HuR参与肺腺癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]的糖酵解过程，而目前关于HuR在结直肠癌糖酵解中的研究较少，作用机制尚不清楚。本课题组前期生物信息分析显示, PFK1上存在m6A修饰位点，且HuR与PFK1表达呈正相关，推测二者存在密切联系。本研究探讨HuR对结直肠癌细胞生物学行为的影响及其与PFK1的关系，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
纳入2022年4—12月就诊于郑州大学附属郑州中心医院的33例结直肠癌患者，收集其结直肠癌组织及其对应的癌旁组织，术后立即将标本冷冻保存于-80 ℃冰箱中待用。本研究经郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会批准并监督(伦理号: 202242), 且获得所有患者的知情同意。纳入标准: ①患者原发癌经组织病理学证实; ②未接受放疗、化疗者; ③临床病历资料完整者。排除标准: ①合并其他恶性肿瘤者; ②已接受相关药物治疗者。
人正常肠上皮细胞NCM460及结直肠癌细胞系HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO购自武汉普诺赛生命科技有限公司; Trizol试剂、RIPA裂解液、反转录试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒及ECL化学发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司; 青霉素、链霉素、胎牛血清、基础培养基、完全培养基购自武汉益普生物公司; Transwell小室、基质胶、细胞培养瓶及6孔板购自Conring公司; 葡萄糖含量检测试剂盒、丙酮酸含量检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技公司; HuR、PFK1、β-actin引物由上海华大基因科技有限公司合成; HuR小干扰RNA(si-HuR-1; si-HuR-2; si-HuR-3)及其阴性对照组(si-NC)由河南睿英生物公司提供; β-actin(兔源，稀释比例1∶ 10 000)、PFK1(兔源，稀释比例1∶ 1 000)一抗抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗抗体均购自Proteintech公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将NCM460、HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO和COLO205细胞置于含有1%青霉素、链霉素、10%胎牛血清的完全培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱内培养。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCT)
使用Trizol试剂提取RNA, 通过反转录试剂盒合成cDNA, 并使用SYBR Green法进行扩增反应, β-actin作为内参。反应条件为: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃下10 s, 60 ℃下30 s, 共45个循环，采用2-△△Ct方法计算HuR、 PFK1 的相对表达量。PCR引物及序列见表 1。
表 1 qRT-PCR引物序列基因名称 引物序列(5′→3′) PFK1 上游: CTACAGTCTCCAACAATGTCCC 下游: CCACCCATAGTCTCAATGATAAAC HuR 上游: GGGTGACATCGGGAGAACG 下游: CTGAACAGGCTTCGTAACTCAT β-actin 上游: CATGTACGTTGCTATCCAGGC 下游: CTCCTTAATGTCACGCACGAT 1.2.3 蛋白免疫印迹实验(Western blot)
收集细胞后，使用RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂从细胞中提取蛋白，通过BCA检测试剂盒进行定量，金属浴煮沸使蛋白变性。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样本，并转移到PVDF膜上, 5%脱脂牛奶封闭1 h, TBST洗涤后，将PVDF膜与特异性一抗PFK1(1∶ 1 000)、β-actin(1∶ 10 000)在4 ℃下孵育过夜。再次TBST洗涤后，加入二抗(1∶ 10 000)在室温下孵育1 h; 将膜置于化学发光成像仪中，均匀加入ECL显色液，观察蛋白条带。β-actin作为内参，通过Image J软件分析蛋白灰度值。
1.2.4 细胞分组
将si-NC、si-HuR-1、si-HuR-2、si-HuR-3分别转染处于对数生长期的HCT116、SW480细胞，命名为si-NC组、si-HuR-1组、si-HuR-2组、si-HuR-3组，转染48 h后进行后续实验。HuR siRNA序列见表 2。
表 2 siRNA序列siRNA 序列(5′→3′) si-NC 正义链: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 反义链: ACGUGACACGUUCGGAGAATT si-HuR-1 正义链: GGUUUGGCUUUGUGACCAUTT 反义链: AUGGUCACAAAGCCAAACCTT si-HuR-2 正义链: GAACGAAUUUGAUCGUCAATT 反义链: UUGACGAUCAAAUUCGUUCTT si-HuR-3 正义链: GGUUUGGGCGGAUCAUCAATT 反义链: UUGAUGAUCCGCCCAAACCTT 1.2.5 细胞划痕实验
将1×105个细胞接种于6孔板中的每个孔中，并生长至100%汇合度，用无菌10 μL移液器枪头垂直划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入不含FBS的基础培养基。计算细胞在第0、24小时的划痕面积。划痕愈合率(%)=(第0小时的划痕面积-第24小时的划痕面积)/第0小时的划痕面积×100%。
1.2.6 Transwell实验
使用含有小室的24孔板(带或不带基质胶涂层)进行迁移和侵袭实验。在上层小室内加入含200 μL细胞悬浮液的无血清培养基(每孔2.5×105个细胞)，并将600 μL含10%FBS的基础培养基加入下层小室中。培养48 h后，用棉签擦去上室的细胞和基质胶, 4%多聚甲醛固定细胞15 min, 0.5%结晶紫染色25 min, 空气风干。在显微镜下观察细胞并拍照，通过Image J软件分析细胞数。
1.2.7 RNA稳定性实验
将1×105个细胞接种于6孔板中的每个孔中，转染48 h后，使用5 μg/mL放线菌素D处理细胞0、3、6 h, 分别收集上述时间点的细胞，提取细胞RNA, 通过qRT-PCR检测 PFK1 mRNA相对表达量。
1.2.8 糖酵解水平检测
将1×105个细胞接种于6孔板中的每个孔中，转染48 h后，收集各组细胞，使用葡萄糖含量检测试剂盒、丙酮酸含量检测试剂盒检测细胞葡萄糖摄取量、丙酮酸生成量。
1.3 统计学方法
应用GraphPad Prism9.0软件进行数据分析，所有数据以均数±标准差表示。HuR、PFK1在结直肠癌及对应癌旁组织的表达量使用配对样本t检验，各细胞组间差异比较使用独立样本t检验进行分析。所有实验均重复3次, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 HuR在结直肠癌组织和细胞系中高表达
基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库分析显示，结直肠癌组织中的HuR表达水平高于正常组织，差异有统计学意义(P < 0.001); 与癌旁组织相比，结直肠癌组织中HuR mRNA表达量升高，差异有统计学意义(P < 0.001); 与人正常肠上皮细胞NCM460相比, HuR在人结直肠癌细胞系HCT8、SW480、SW620、HCT116、LoVo、RKO和COLO205细胞中的表达量升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 其中HCT116、SW480细胞的HuR表达水平相对较高，选择HCT116、SW480细胞进行后续实验。将3种实验组siRNA-HuR及阴性对照组转染到HCT116、SW480细胞中，相较于对照组，实验组HuR mRNA表达量显著下降，其中si-HuR-1和si-HuR-3的差异最为显著(P < 0.01), 说明转染明显有效，选择si-HuR-1和si-HuR-3进行后续细胞功能试验。见图 1。
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图 1 HuR在结直肠癌组织和细胞系中的表达以及构建敲减细胞系A: HuR(基因名称为ELAVL1)在GEPIA数据库的表达水平(红色代表结直肠癌组织，蓝色代表正常组织)，与正常组织比较, ***P < 0.001; B: qRT-PCR检测HuR在临床标本中的表达水平，与癌旁组织比较, ***P < 0.001; C: qRT-PCR检测HuR在人正常肠上皮细胞和7种结直肠癌细胞系中的表达水平，与NCM460比较, *P < 0.05, ***P < 0.001; D、E: qRT-PCR检测HuR在HCT116、SW480细胞中的敲减效率，与si-NC比较, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.2 敲低HuR抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭
与对照组si-NC相比，实验组si-HuR-1、si-HuR-3的划痕愈合率下降，差异有统计学意义(P < 0.05)，见图 2; 与对照组si-NC相比，实验组si-HuR-1、si-HuR-3的迁移细胞数、侵袭细胞数减少，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3。
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图 2 敲低HuR抑制HCT116、SW480细胞迁移能力A: 敲低HuR对HCT116细胞迁移的影响; B: 敲低HuR对SW480细胞迁移的影响。与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01。![]()
图 3 敲低HuR抑制HCT116、SW480细胞迁移和侵袭能力(结晶紫染色放大100倍)A: 敲低HuR对HCT116、SW480细胞迁移的影响; B: 敲低HuR对HCT116、SW480细胞侵袭的影响。与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01。2.3 敲低HuR抑制结直肠癌细胞糖酵解
与对照组si-NC相比，实验组si-HuR-1、si-HuR-3的葡萄糖摄取量均降低，差异有统计学意义(P < 0.05); 敲低HuR使HCT116、SW480细胞的丙酮酸生成量均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 4。
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图 4 敲低HuR抑制HCT116、SW480细胞的葡萄糖摄取量和丙酮酸生成量A: 敲低HuR对HCT116、SW480葡萄糖摄取量的影响; B: 敲低HuR对HCT116、SW480细胞丙酮酸生成量的影响。与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.4 敲低HuR抑制结直肠癌细胞 PFK1 mRNA和蛋白的表达量
GEPIA数据库分析显示PFK1在结直肠癌中高表达，差异有统计学意义(P < 0.001); PFK1 mRNA在结直肠癌组织中的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P < 0.001); GEPIA数据库分析显示，结直肠癌组织中HuR与PFK1表达水平呈正相关; 与对照组相比，实验组 PFK1 mRNA及其蛋白的表达量均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 5。
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图 5 敲低HuR抑制HCT116、SW480细胞中PFK1 mRNA和蛋白表达量A: PFK1(基因名称为PFKM)在GEPIA数据库的表达水平，红色代表结直肠癌组织，蓝色代表正常组织，与正常组织比较, ***P < 0.001; B: qRT-PCR检测PFK1在临床标本中的表达量，与癌旁组织比较, ***P < 0.001; C: GEPIA数据库中HuR与PFK1的相关性分析; D、E: qRT-PCR检测敲低HuR对HCT116、SW480细胞PFK1 mRNA表达的影响，与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01; F、G: 蛋白印迹法检测敲低HuR对HCT116、SW480细胞PFK1蛋白表达的影响，与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01。2.5 敲低HuR抑制 PFK1 mRNA的稳定性
利用RMBase数据库分析发现PFK1上存在着m6A修饰的序列; 使用m6AVar数据库显示基因组上的功能变异能够使PFK1上的m6A修饰的序列发生改变，并且RM2Target算法预测PFK1能够与HuR存在直接结合; 敲低HuR降低了PFK1的mRNA半衰期，即抑制 PFK1 mRNA稳定性，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 6。
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图 6 敲低HuR抑制HCT116、SW480细胞中PFK1 mRNA稳定性A、B、C: 生物信息学分析预测HuR(基因名称为ELAVL1)与PFK1(基因名称为PFKM)结合，且PFK1上存在m6A修饰位点; D: qRT-PCR检测敲低HuR对HCT116、SW480细胞PFK1 mRNA半衰期的影响，与si-NC比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。3. 讨论
m6A修饰是真核生物mRNA中最丰富的内部修饰，参与多种生物过程，如RNA剪接、稳定性和翻译[12]。HuR是m6A修饰中的重要成员，在癌症的进展中发挥重要作用[13]。DUAN X H等[14]发现敲低HuR可通过降低肺癌细胞 FGFRL1 mRNA的稳定性抑制化疗耐药性，进而诱导其凋亡。LIU H L等[15]研究显示HuR在肝癌中高表达，抑制HuR的表达能够降低 MMP1 mRNA的稳定性，进一步抑制肝癌细胞的增殖能力。上述研究结果显示, HuR可能可以成为提示肿瘤进展和预后的潜在分子靶点。目前国内外对HuR在结直肠癌中的研究较少，作用机制尚不清楚。本研究中, GEPIA数据库显示HuR (基因名称为 ELAVL1 )在结直肠癌组织中高表达，这一结果在临床样本中得到了验证, HuR在结直肠癌组织中的表达量显著高于癌旁组织。通过体外细胞实验发现HuR mRNA的表达量在HCT116、SW480细胞中升高，因此选择HCT116、SW480细胞作为研究对象进行后续功能学研究。敲低HuR后，实验组细胞划痕愈合率、细胞迁移数和细胞侵袭数均降低，提示敲低HuR能够抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力。
“Warburg效应”的特征是葡萄糖摄取和乳酸产生增强，乳酸的产生为肿瘤细胞提供了酸性环境，促使肿瘤细胞进一步增殖、迁移、侵袭以及抵抗凋亡，同时诱导分泌血管内皮生成因子为肿瘤细胞生长提供养料[16-17]。为探讨HuR是否参与结直肠癌糖酵解途径，通过检测葡萄糖摄取水平和丙酮酸生成水平，发现敲低HuR可以抑制HCT116、SW480细胞的葡萄糖摄取量、丙酮酸生成量，证明HuR参与并促进结直肠癌的糖酵解途径。
肿瘤细胞有氧糖酵解能力是正常细胞的20~30倍，为肿瘤代谢提供大量能量和中间产物[3]。研究[18]显示，抑制肿瘤细胞糖酵解途径能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，甚至可以起到杀伤肿瘤细胞的作用。因此阻断有氧糖酵解目前被认为是一种有前景的肿瘤治疗策略，靶向糖酵解等异常环节的代谢酶也成为抗肿瘤治疗的重点[19]。PFK1是糖酵解的主要限速酶和主要调节点，催化6-磷酸果糖生成1, 6-二磷酸果糖(F2-6BP)[20]。既往研究[21]显示, PFK1不仅能够参与糖酵解过程，还在多种肿瘤中扮演着重要角色，如下调PFK1抑制肝癌细胞增殖能力，过表达PFK1可促进肺癌生长和转移[22]。本研究中, GEPIA数据库分析显示PFK1(编码基因PFKM)在结直肠癌组织中显著高表达，并且与HuR表达水平呈正相关; 进一步通过qRT-PCR验证显示PFK1在结直肠癌组织中的表达量显著升高; 敲低HuR后，HCT116、SW480细胞中 PFK1 mRNA和蛋白表达量降低，提示敲低HuR能够抑制PFK1表达。HuR是一种关键的m6A阅读蛋白，其发挥作用的机制可能为: 首先，通过生物信息学分析预测HuR与PFK1(编码基因PFKM)结合，且PFK1上存在m6A修饰位点; 其次，通过RNA稳定性实验发现敲低HuR可以抑制 PFK1 mRNA半衰期，即降低 PFK1 mRNA稳定性。本研究并未进行实验证明PFK1上存在m6A位点，后续将通过甲基化RNA免疫共沉淀实验(MeRIP)来验证。
综上所述, m6A阅读蛋白HuR在结直肠癌中高表达，可能通过识别结合PFK1上的m6A位点，降低 PFK1 mRNA稳定性，从而调控结直肠癌细胞的迁移、侵袭和糖酵解能力。
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表 1 2组PVS患者基线资料比较(x±s)[n(%)]
组别 n 性别 平均年龄/岁 平均病程/月 病因类型 男 女 脑出血 颅脑外伤 其他 观察组 28 19(67.86) 9(32.14) 44.36±2.67 2.54±0.69 11(39.29) 12(42.86) 5(17.86) 对照组 27 17(62.96) 10(37.04) 45.23±2.43 2.78±0.53 9(33.33) 14(51.85) 4(14.81) 
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表 1 2组PVS患者基线资料比较(x±s)[n(%)]
组别 n 性别 平均年龄/岁 平均病程/月 病因类型 男 女 脑出血 颅脑外伤 其他 观察组 28 19(67.86) 9(32.14) 44.36±2.67 2.54±0.69 11(39.29) 12(42.86) 5(17.86) 对照组 27 17(62.96) 10(37.04) 45.23±2.43 2.78±0.53 9(33.33) 14(51.85) 4(14.81)
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表 2 2组PVS患者不同时点GCS评分比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗4周后 治疗8周后 12周随访时 观察组 28 5.69±1.34 7.67±1.53*# 8.46±1.89*# 9.86±1.91*# 对照组 27 5.78±1.31 6.78±1.47* 7.38±1.41* 8.01±1.56* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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表 2 2组PVS患者不同时点GCS评分比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗4周后 治疗8周后 12周随访时 观察组 28 5.69±1.34 7.67±1.53*# 8.46±1.89*# 9.86±1.91*# 对照组 27 5.78±1.31 6.78±1.47* 7.38±1.41* 8.01±1.56* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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表 3 2组PVS患者不同时点CRS-R评分比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗4周后 治疗8周后 12周随访时 观察组 28 3.68±1.26 6.28±1.76*# 7.89±2.23*# 8.89±1.87*# 对照组 27 3.58±1.37 5.12±2.06* 6.28±2.37* 7.21±1.27* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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表 3 2组PVS患者不同时点CRS-R评分比较(x±s)
分 组别 n 治疗前 治疗4周后 治疗8周后 12周随访时 观察组 28 3.68±1.26 6.28±1.76*# 7.89±2.23*# 8.89±1.87*# 对照组 27 3.58±1.37 5.12±2.06* 6.28±2.37* 7.21±1.27* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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表 4 2组PVS患者EEG分级比较[n(%)]
组别 n 时点 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 Ⅴ级 观察组 28 治疗前 0 5(17.86) 7(25.00) 14(50.00) 2(7.14) 治疗后 10(35.71)*# 8(28.57)*# 6(21.43)*# 4(14.29)*# 0*# 对照组 27 治疗前 0 6(22.22) 7(25.93) 12(44.44) 2(7.41) 治疗后 8(29.63)* 7(25.93)* 5(18.52)* 6(22.22)* 1(3.70)* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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表 4 2组PVS患者EEG分级比较[n(%)]
组别 n 时点 Ⅰ级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 Ⅴ级 观察组 28 治疗前 0 5(17.86) 7(25.00) 14(50.00) 2(7.14) 治疗后 10(35.71)*# 8(28.57)*# 6(21.43)*# 4(14.29)*# 0*# 对照组 27 治疗前 0 6(22.22) 7(25.93) 12(44.44) 2(7.41) 治疗后 8(29.63)* 7(25.93)* 5(18.52)* 6(22.22)* 1(3.70)* 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。
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