Regulatory mechanism of HIF-1α/HO-1/VEGF-A signaling pathway in immaturity of autogenous arteriovenous fistula
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摘要:目的
观察慢性肾脏病5期、行自体动静脉内瘘(AVF)患者在内瘘不同成熟结局条件下低氧诱导因子-1α/血红素加氧酶-1/血管内皮生长因子A(HIF-1α/HO-1/VEGF-A)信号通路的表达水平差异，探讨HIF-1α/HO-1/VEGF-A信号通路在AVF成熟过程中的调控机制。
方法选取慢性肾脏病5期、拟行AVF手术的45例患者作为研究对象，在内瘘手术过程中采集血管标本，依据术后8周内瘘成熟结局分为AVF成熟组(n=35)和AVF成熟不良组(n=10)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HIF-1α/HO-1/VEGF-A信号通路HIF-1α、HO-1、VEGF-A的基因表达水平; 采用蛋白免疫印迹法检测HIF-1α、HO-1、VEGF-A的蛋白表达水平; 采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测下游炎症因子如白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、转化生长因子-β(TGF-β)表达水平。
结果AVF成熟组HIF-1α mRNA、HO-1 mRNA、VEGF-A mRNA表达水平高于AVF成熟不良组，差异有统计学意义(P < 0.01); AVF成熟组HIF-1α、HO-1、VEGF-A蛋白表达水平高于AVF成熟不良组，差异有统计学意义(P < 0.01); AVF成熟组IL-1β、IL-8、TGF-β表达水平低于AVF成熟不良组，差异有统计学意义(P < 0.01)。
结论HIF-1α/HO-1/VEGF-A信号通路表达水平的上调有利于内瘘的早期成熟。HIF-1α/HO-1/VEGF-A信号通路表达水平的测定对AVF的早期成熟结局有一定的预测意义。
Abstract:ObjectiveTo observe the differences in the expression levels of the hypoxia-inducible factor-1α/heme oxygenase-1/vascular endothelial growth factor A (HIF-1α/HO-1/VEGF-A) signaling pathway under different maturation outcomes of arteriovenous fistula (AVF) in patients with stage 5 chronic kidney disease, and explore the regulatory mechanism of the HIF-1α/HO-1/VEGF-A signaling pathway in the maturation process of AVF.
MethodsA total of 45 patients with AVF surgery for stage 5 chronic kidney disease were selected as research objects, vascular specimens were collected during the AVF surgery, and the patients were divided into AVF maturation group (n=35) and AVF poor maturation group (n=10) based on the AVF maturation outcomes within 8 weeks after surgery. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the gene expression levels of HIF-1α, HO-1 and VEGF-A in the HIF-1α/HO-1/VEGF-A signaling pathway; the Western blotting was used to detect the protein expression levels of HIF-1α, HO-1 and VEGF-A; the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression levels of downstream inflammatory factors such as interleukin-1β (IL-1β), interleukin-8 (IL-8), and transforming growth factor-β (TGF-β).
ResultsThe expression levels of HIF-1α mRNA, HO-1 mRNA, and VEGF-A mRNA in the AVF maturation group were significantly higher than those in the AVF poor maturation group (P < 0.01); the protein expression levels of HIF-1α, HO-1 and VEGF-A in the AVF maturation group were significantly higher than those in the AVF poor maturation group (P < 0.01); the expression levels of IL-1β, IL-8 and TGF-β in the AVF maturation group were significantly lower than those in the AVF poor maturation group (P < 0.01).
ConclusionThe upregulation of the HIF-1α/HO-1/VEGF-A signaling pathway is conducive to the early maturation of AVF. The measurement of the expression levels of the HIF-1α/HO-1/VEGF-A signaling pathway has a certain predictive significance for the early maturation outcome of AVF.
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开放性眼外伤(OGI)是所有年龄段人群获得性视力丧失的主要原因[1-2]。创伤后感染性眼内炎是OGI最严重的并发症之一，其由接种病原体引起，病原体可以是正常的眼部菌群，也可以是环境中的其他微生物，但均会分解、破坏视网膜组织，导致视力下降，增加眼球摘除的风险。研究[3-4]报道，开放性外伤后感染性眼内炎的发生率为4%~16%, 与其他眼内感染(例如术后眼内炎)相比，外伤后眼内炎患者的最终视力结果更差。本研究探讨OGI后感染性眼内炎发生的相关危险因素，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
本研究采取回顾性病例对照研究设计，收集2017年1月—2021年12月在泰州市人民医院住院的OGI患者的临床资料，使用病历系统查询在出院诊断中明确诊断为“角膜穿通伤”“眼球破裂伤”“眼内异物(IOFB)”的病例。纳入标准: 根据伯明翰眼外伤术语系统(BETT)[5]定义为角膜或巩膜全层撕裂伤者。排除标准: ①闭合性眼外伤者，包括角膜和(或)巩膜板层裂伤、眼球钝挫伤; ② OGI一期行眼球摘除术者; ③病历系统资料不完善者。本研究遵守《赫尔辛基宣言》的要求，经江苏省泰州市人民医院伦理委员会审批(受理号: KY2022-087-01), 并获得知情同意豁免审批。
1.2 方法
根据是否并发感染性眼内炎分为眼内炎组和非眼内炎组，收集并记录患者的一般资料(年龄、性别、眼别、空腹血糖)、受伤情况(外伤类型、伤口缝合时间、伤口位置、IOFB类型)、临床体征(伤口闭合情况、虹膜脱出、晶体前囊破裂、晶体悬韧带断裂、玻璃体溢出)等资料。根据BETT的定义，将眼部损伤类型分为3类: 无IOFB穿通伤、有IOFB的穿通伤和破裂伤。伤口位置定义为Ⅰ区(裂伤仅限于角膜)、Ⅱ区(累及巩膜的裂伤，距角巩膜缘5 mm以内)和Ⅲ区(累及后巩膜的裂伤，超过5 mm角巩膜缘)[6]。
1.3 外伤后感染性眼内炎的诊断
外伤后感染性眼内炎主要根据临床表现、眼部B超进行诊断。主要临床表现有眼红、眼痛、脓性分泌物、前房积脓、玻璃体混浊。采用眼部B超检查玻璃体的混浊程度。
1.4 统计学方法
采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。正态分布的连续变量以(x±s)表示。分类变量采用例数和百分率表示。单因素分析中，组间分类变量的比较采用χ2检验，连续变量的比较采用独立样本t检验。考虑到混杂因素，多因素分析需将单因素分析中P < 0.05的因素纳入条件逐步Logistic回归分析[7]。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
本研究共纳入216例患者(216只眼)，其中男174例，女42例，年龄(52.0±13.0)岁。将216例患者分为眼内炎组33例(15.3%)、非眼内炎组183例(84.7%)。眼内炎组男32例，女1例，右眼13例，左眼20例，年龄(55.0±11.0)岁; 非眼内炎组男142例，女41例，右眼88例，左眼95例，年龄(51.0±13.0)岁。
2.2 外伤后感染性眼内炎相关因素的单因素分析
眼内炎组与非眼内炎组在年龄、眼别、伤口缝合时间、虹膜脱出、晶体悬韧带断裂、玻璃体溢出等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。2组性别、外伤类型、伤口闭合情况、伤口位置、IOFB类型、晶体前囊破裂、空腹血糖比较，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见表 1、表 2、表 3。
表 1 2组患者一般资料比较(x±s)[n(%)]相关因素 分类 非眼内炎组(n=183) 眼内炎组(n=33) χ2/t P 年龄/岁 51.0±13.0 55.0±11.0 1.57 0.117 眼别 右眼 88(48.09) 13(39.39) 0.85 0.357 左眼 95(51.91) 20(60.61) 性别 男 142(77.60) 32(96.97) 6.70 0.010 女 41(22.40) 1(3.03) 空腹血糖 ≥6.1 mmol/L 30(16.39) 19(57.57) 42.90 < 0.001 < 6.1 mmol/L 153(83.61) 14(42.43) 表 2 2组患者受伤情况比较[n(%)]相关因素 分类 非眼内炎组(n=183) 眼内炎组(n=33) χ2/t P 外伤类型 眼内异物穿通伤 45(24.59) 20(60.61) 17.24 < 0.001 穿通伤及破裂伤 138(75.41) 13(39.39) 伤口缝合时间 ≥24 h 54(29.51) 15(45.45) 3.27 0.071 < 24 h 129(70.49) 18(54.55) 伤口位置 Ⅰ区 103(56.28) 28(84.85) 9.59 0.002 Ⅱ、Ⅲ区 80(43.72) 5(15.15) 眼内异物类型 金属异物 39(21.31) 16(48.48) 10.88 0.001 非金属异物及无异物 144(78.69) 17(51.52) 表 3 2组患者临床体征比较[n(%)]相关因素 分类 非眼内炎组(n=183) 眼内炎组(n=33) χ2/t P 虹膜脱出 是 67(36.61) 11(33.33) 0.13 0.718 否 116(63.39) 22(66.67) 玻璃体溢出 是 68(37.16) 10(30.30) 0.57 0.450 否 115(62.84) 23(69.70) 晶体前囊破裂 是 44(24.04) 19(57.58) 15.22 < 0.001 否 139(75.96) 14(42.42) 晶体悬韧带断裂 是 29(15.85) 9(27.27) 2.52 0.113 否 154(84.15) 24(72.73) 伤口自闭 是 45(24.59) 16(48.48) 7.88 0.005 否 138(75.41) 17(51.52) 2.3 外伤后感染性眼内炎相关因素的多因素分析
以非眼内炎组为参照，条件逐步Logistic回归分析显示IOFB穿通伤、晶体前囊破裂、空腹血糖≥6.1 mmol/L是外伤后感染性眼内炎的相关危险因素(P < 0.05)。合并IOFB穿通伤(OR=3.504, 95%CI: 1.382~8.885)、晶体前囊破裂(OR=4.547, 95%CI: 1.717~12.040)、空腹血糖≥6.1 mmol/L(OR=15.012, 95%CI: 5.683~39.656)的OGI患者易并发感染性眼内炎。见表 4。
表 4 感染性眼内炎的条件Logistic回归分析相关因素 回归系数 标准误差 Wald P OR 95%CI 眼内异物穿通伤 1.254 0.475 6.973 0.008 3.504 1.382~8.885 晶体前囊破裂 1.514 0.497 9.289 0.002 4.547 1.717~12.040 空腹血糖≥6.1 mmol/L 2.709 0.496 29.874 < 0.001 15.012 5.683~39.656 3. 讨论
OGI破坏了眼球原有的完整结构，致使病原菌更容易进入眼内，是感染性眼内炎最常见的发生原因[8]。对于创伤性眼内炎患者，其视力的预后与损伤的性质和程度、诊断和治疗的时机以及接种微生物的毒力有关，其治疗原则为全身使用敏感抗生素、玻璃体腔注射抗菌药物以控制眼内炎症、用药前抽取玻璃体液行细菌和真菌培养及药敏试验，必要时尽早行玻璃体切除术[9]。李焕深等[10]报道外伤性眼内炎行玻璃体切除术联合玻璃体腔药物灌洗治疗后，视力>0.02者所占比率由术前的0%(0/24)上升至25%(6/24)。因此，眼内炎的早期诊断与治疗是至关重要的，对于有感染危险因素的患者应重点观察，越早发现感染并给予系统的药物保守治疗或玻璃体内注射抗生素即可控制感染[11]。
本研究结果显示, IOFB穿通伤、晶体前囊破裂、空腹血糖≥6.1 mmol/L是OGI后发生感染性眼内炎的危险因素(OR>1, P < 0.05)。发生OGI后, IOFB的存在与眼内炎的发生之间的关系仍存在争议。有研究[12]认为IOFB的存在是眼内炎的危险因素。金属致伤物的风险较高[13]。王化峰等[14]认为IOFB的存在及其性质与眼内炎的发生无相关性。污染的伤口是OGI发生感染的风险因素。本研究中, IOFB与眼内炎的发生存在显著关联，但在多因素分析中异物性质与眼内炎发生无显著关联，考虑到本研究中的大多数IOFB穿通伤患者从事建筑工作，异物可能被污染。
既往研究[15]认为，晶体前囊破裂也是眼内炎发生的危险因素。晶体前囊破裂后，皮质溢出于前房，晶状体颗粒渗漏诱发炎性反应，前房炎性的环境有利于细菌的繁殖。本研究中，晶体前囊破裂多为Ⅰ区穿通伤，皮质与致伤物的直接接触也增加了细菌植入的概率。本研究发现空腹血糖≥ 6.1 mmol/L的外伤患者比空腹血糖 < 6.1 mmol/L的外伤患者的眼内炎发生率更高，其中很多空腹血糖≥6.1 mmol/L的眼内炎患者既往无糖尿病史。空腹血糖的升高反映了胰岛功能的异常，患者体内很可能长期处于高糖状态，致使血浆渗透压上升，血清中脑源性神经营养因子、血管生成素表达增加[16]。糖尿病早期无视网膜病变时，视网膜血管免疫反应增强，高血糖介导的细胞外基质蛋白纤维连接蛋白和胶原生成增加以及降解过程受损[17-19]。上述多种因素为病原菌创造了生长、繁殖的有利条件，使感染性眼内炎发生率增加。
国际医学界针对外伤性眼内炎的危险因素进行了很多研究，有专家[20]建议建立一个可能发生感染性眼内炎的高危OGI风险评分系统，在此系统中，评分最高的(评分10分)风险因素是创口延迟修复(>12 h), 其次是伤口污染(8.2分)、晶状体-虹膜隔破裂(5.2分)、晶体囊膜破裂(3.8分)、IOFB存在(2.1分)。本研究中，伤口延迟缝合在单因素分析中差异无统计学意义，考虑与本研究样本量相对较少有关。
综上所述, IOFB穿通伤、晶体前囊破裂、空腹血糖≥6.1 mmol/L是OGI后感染性眼内炎的危险因素，建议立即为高危OGI患者提供预防性全身抗生素治疗或者玻璃体内注射抗生素治疗。
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图 1 AVF成熟组与AVF成熟不良组患者标本HE染色图(放大倍数200倍)
A、C: AVF成熟组患者的HE染色结果，图A提示AVF成熟组的内膜排列整齐，为单层式排列，中膜无明显增生、增厚; B、D: AVF成熟不良组HE染色结果，图D黑色箭头提示AVF成熟不良组血管壁中可见散在浆细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。
表 1 2组患者一般资料比较(x±s)[n(%)]
组别 n 年龄/岁 性别 男 女 AVF成熟组 35 54.17±7.05 19(54.29) 16(45.71) AVF成熟不良组 10 54.30±5.15 6(60.00) 4(40.00) 
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表 2 2组患者术前空腹血糖、甘油三酯、胆固醇、血钙、血磷水平比较(x±s)
mmol/L 指标 AVF成熟不良组(n=10) AVF成熟组(n=35) 空腹血糖 4.66±0.40 4.91±0.54 甘油三酯 1.81±0.30 1.75±0.27 总胆固醇 3.70±0.48 3.46±0.34 血钙 2.23±0.14 2.33±0.19 血磷 1.51±0.18 1.58±0.31
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表 3 2组患者 HIF-1α 、 HO-1 、VEGF-A的mRNA表达水平比较(x±s)
指标 AVF成熟不良组(n=10) AVF成熟组(n=35) HIF-1α mRNA 0.88±0.20 2.24±0.64** HO-1 mRNA 1.01±0.25 2.28±0.85** VEGF-A mRNA 1.31±0.43 3.25±1.05** HIF-1α : 低氧诱导因子-1α; HO-1 : 血红素加氧酶-1;
VEGF-A: 血管内皮生长因子A。
与AVF成熟不良组比较, * * P < 0.01。
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表 4 2组患者HIF-1α、HO-1、VEGF-A的蛋白表达水平比较(x±s)
指标 AVF成熟不良组(n=10) AVF成熟组(n=35) HIF-1α 0.34±0.16 0.83±0.19** HO-1 0.22±0.06 0.44±0.12** VEGF-A 0.07±0.01 0.53±0.19** HIF-1α: 低氧诱导因子-1α; HO-1: 血红素加氧酶-1;
VEGF-A: 血管内皮生长因子A。
与AVF成熟不良组比较, * * P < 0.01。
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表 5 2组患者IL-1β、IL-8、TGF-β表达水平(x±s)
pg/mL 指标 AVF成熟不良组(n=10) AVF成熟组(n=35) IL-1β 48.55±2.68 37.03±3.39** IL-8 108.87±8.77 90.09±6.52** TGF-β 28.12±1.41 18.45±2.20** IL-1β: 白细胞介素-1β; IL-8: 白细胞介素-8;
TGF-β: 转化生长因子-β。
与AVF成熟不良组比较, * * P < 0.01。
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