Effects of glycosylphosphatidylinositol-anchored HDL-binding protein on glioma growth and macrophage infiltration
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摘要:目的
探讨糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1 (GPIHBP1)对胶质瘤生长及巨噬细胞浸润的影响。
方法首先，利用TCGA数据库分析人GPIHBP1在胶质瘤样本中的表达及巨噬细胞浸润情况，并在临床组织样本中验证上述生物信息学分析结果; 通过构建稳定过表达GPIHBP1的胶质瘤细胞系，进一步探讨GPIHBP1过表达对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。最后，通过荷瘤实验验证GPIHBP1过表达对肿瘤生长及巨噬细胞浸润的影响。
结果TCGA数据库分析显示, GPIHBP1在低级别胶质瘤中的表达高于正常组织，在高级别胶质瘤中的表达低于正常组织。此外，低级别胶质瘤中GPIHBP1的表达水平高于高级别胶质瘤，这一结果通过免疫组织化学(IHC)实验得到验证。Western blot分析验证了过表达GPIHBP1的胶质瘤细胞系构建成功。CCK-8、流式细胞术、划痕实验和Transwell实验结果显示，该稳转细胞株的增殖能力减弱，迁移能力和侵袭能力降低。荷瘤实验进一步表明，该稳转细胞株的肿瘤生长能力降低，巨噬细胞浸润减少。
结论GPIHBP1在不同分级胶质瘤中的表达差异可能与肿瘤进展相关。过表达GPIHBP1可抑制胶质瘤生长，其可能是通过影响肿瘤微环境，促进巨噬细胞向具有抗肿瘤作用的M1型极化，进而抑制胶质瘤生长。
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关键词:
- 糖基化磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1 /
- 胶质瘤 /
- 增殖 /
- 巨噬细胞 /
- 肿瘤微环境
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of glycosylphosphatidylinositol-anchored HDL-binding protein (GPIHBP1) on glioma growth and macrophage infiltration.
MethodsInitially, the expression of GPIHBP1 in glioma samples and macrophage infiltration were analyzed using TCGA database, and these bioinformatics results were validated in clinical tissue samples. A stable glioma cell line overexpressing GPIHBP1 was then established to further explore the effects of GPIHBP1 overexpression on glioma cell proliferation, apoptosis, migration, and invasion. Finally, the impact of GPIHBP1 overexpression on tumor growth and macrophage infiltration was verified through xenograft experiments.
ResultsTCGA database analysis revealed that GPIHBP1 expression was higher in low-grade gliomas compared to normal tissues, while it was lower in high-grade gliomas. Additionally, the expression level of GPIHBP1 in low-grade gliomas was higher than in high-grade gliomas, which was confirmed by immunohistochemistry (IHC). Western blot analysis confirmed the successful construction of the GPIHBP1-overexpressing glioma cell line. CCK-8, flow cytometry, scratch and Transwell assays demonstrated that the proliferation, migration and invasion capabilities of the stable cell line were reduced compared to the control group. Xenograft experiments further showed that the tumor growth and macrophage infiltration were decreased in the stable cell line.
ConclusionThe differential expression of GPIHBP1 in different grades of gliomas may be associated with tumor progression. Overexpression of GPIHBP1 can inhibit glioma growth, possibly by influencing the tumor microenvironment and promoting the polarization of macrophages towards the antitumor M1 phenotype, thereby inhibiting glioma growth.
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双黄连由金银花[1-2]、黄芩[3-4]和连翘[5-6]这3味药组成，临床上常被用于治疗呼吸道感染性疾病等。既往研究[7]表明，双黄连可抑制H9N2亚型禽流感病毒(AIV)引起的小鼠肺炎实变，延长生存时间，降低肺病毒滴度。近年来，双黄连在临床应用中的不良反应报道多见，尤以注射剂型最为显著，极少数患者可出现过敏性休克甚至死亡[8-10]。双黄连不良反应的发生率和严重程度与药物剂型密切相关，注射剂型高于口服剂型[11-12]。雾化吸入是临床常用的给药途径，可将药物直接输送到患者的呼吸道内，可达到较高的局部药物浓度，减少全身不良反应[13-14]。目前，双黄连以雾化吸入方式治疗H9N2亚型AIV的研究尚未见报道。本研究以H9N2亚型AIV感染小鼠建立模型，进行双黄连雾化吸入(SHL Inh)干预，通过观察小鼠肺部炎症和肺病毒滴度，评价双黄连雾化给药对小鼠H9N2亚型AIV感染的疗效，并比较雾化给药与注射给药疗效的差异，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 实验动物和病毒
Balb/c小鼠45只, 5~6周龄，雌性，无特定病原体(SPF)级，体质量(15.20±0.93) g, 广东省医学实验动物中心提供，合格证编号44007200059858。H9N2亚型AIV, A/Chicken/Guangdong/1996(H9N2), 华南农业大学陈建新教授馈赠，本实验室扩增保存。
1.2 实验药物与试剂
注射用双黄连(冻干)，哈药集团中药二厂提供，批号1807508。奥司他韦，罗氏制药提供，编号HEC-Amms-0910017。ELISA试剂盒(R & D Systems品牌，购自上海优宁维生物科技股份有限公司)，白细胞介素-6(IL-6)(货号M6000B)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(货号MTA00B)和重组人趋化因子CXCL9(MIG)(货号MCX900)。
1.3 仪器
电子天平，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司生产，型号AL20l。倒置显微镜，莱卡(Leica)公司生产，型号DM 3000。分光光度计，赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产，型号NanoDrop 2000。压缩式雾化器，欧姆龙(大连)有限公司生产，型号C28P。小鼠雾化箱，自制。
1.4 动物分组
将45只BALB/c小鼠适应性饲养7 d, 随机分为正常对照组、病毒对照组、奥司他韦组(阳性药对照)、双黄连腹腔注射(SHL Ip)组(标准对照)和SHL Inh组共5组，每组9只。
1.5 实验处理及给药
正常对照组经鼻滴入磷酸盐缓冲液(PBS), 其他4组均经鼻吸入2个半数致死量(2 LD50)H9N2亚型AIV; 正常对照组和病毒对照组滴鼻后予蒸馏水灌胃(10 mL/kg); 奥司他韦组予奥司他韦灌胃, 75 mg/(kg·d); SHL Ip组予双黄连腹腔注射, 3 000 mg/(kg·d)。SHL Inh组予置入自制雾化箱雾化吸入给药。自制雾化箱长、宽、高分别为40、30、30 cm, 设置出入口1.5 cm2, 入口处接雾化器，出口处开放排入通风安全柜。雾化药液以无菌蒸馏水溶解注射用双黄连冻干粉，浓度为300 mg/mL, 超声雾化器以0.5 mL/min的速率持续雾化双黄连药液，气雾经导管导入雾化箱内，小鼠置于雾化箱内，以全身暴露方式[15]经鼻吸入双黄连气雾。2次/d, 1 h/次。各组均采取上述方式连续给药5 d。
1.6 标本收集与检测
每日记录各组小鼠体质量，直至第5天，处死后取肺称重，计算肺指数，肺指数=[肺质量(g)/体质量(g)]×100%[16]。取部分肺组织制作HE病理切片，其余肺组织匀浆后测定肺病毒滴度[半数组织培养感染剂量(TCID50)]、炎症因子[IL-6、MIG和TNF-α]水平。肺病毒滴度TCID50采用Reed-Muench法[17]计算。
1.7 统计学方法
采用Prism 5.0分析数据，计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 SHL Inh对H9N2亚型AIV感染小鼠体质量下降的抑制作用
正常对照组小鼠体质量变化率增高至(120.0±4.9)%, 病毒对照组小鼠体质量变化率降低至(87.4±5.7)%, 差异有统计学意义(P < 0.01), 感染小鼠模型成立。奥司他韦组小鼠体质量变化率增高至(108.8±5.3)%, 与病毒对照组比较，差异有统计学意义(P < 0.05), 而SHL Inh组、SHL Ip组体质量变化率分别降低至(90.9±5.8)%、(90.2±4.8)%, 与病毒对照组比较，均未能抑制感染小鼠的体质量下降，差异无统计学意义(P>0.05)。见图 1。
2.2 SHL Inh对H9N2亚型AIV感染小鼠肺指数的影响
正常对照组小鼠肺指数为(0.65±0.04)%, 病毒对照组小鼠肺指数为(1.44±0.13)%, 差异有统计学意义(P < 0.001), 感染小鼠模型成立。与病毒对照组比较，奥司他韦组、SHL Inh组、SHL Ip组小鼠肺指数(0.99±0.05)%、(1.27±0.08)%、(1.11±0.11)%均降低, 差异有统计学意义(P < 0.001或P < 0.01)。SHL Inh组肺指数高于SHL Ip组，差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 2。
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图 2 各组小鼠的肺指数与正常对照组比较, ***P < 0.001;
与病毒对照组比较, ##P < 0.01, ###P < 0.001;
与SHL Ip组比较, △△P < 0.01。2.3 SHL Inh对H9N2亚型AIV感染小鼠肺病毒滴度的影响
病毒对照组病毒滴度为(4.06±0.41) lgTCID50/g, 奥司他韦组、SHL Inh组和SHL Ip组病毒滴度依次为(3.29±0.27)、(3.44±0.46)、(3.33±0.43) lgTCID50/g, 均低于病毒对照组病毒滴度，差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。SHL Inh组与SHL Ip组病毒滴度的差异无统计学意义(P>0.05)。见图 3。
2.4 SHL Inh对H9N2亚型AIV感染小鼠肺组织病理的影响
正常对照组肺组织病理表现: 血管周围未见炎性浸润，肺泡间隔无增厚，肺泡无炎性浸润。病毒对照组肺组织病理表现: 血管周围炎性浸润且管壁增厚，肺泡间隔增厚，肺泡炎性浸润。奥司他韦组、SHL Ip组和SHL Inh组肺组织病理表现亦有血管周围炎症浸润，肺泡间隔增厚，但奥司他韦组、SHL Ip组和SHL Inh组肺泡无明显炎性浸润。见图 4。
2.5 SHL Inh对H9N2亚型AIV感染小鼠肺组织炎症因子的影响
与正常对照组比较，其他4组肺匀浆炎症因子IL-6、MIG和TNF-α水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.01或P < 0.001), 感染小鼠模型成立。与病毒对照组比较，奥司他韦组IL-6、MIG和TNF-α均较低, SHL Ip组IL-6较低，差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.001)。见图 5。
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图 5 各组小鼠肺组织炎症因子水平A: 各组IL-6水平比较; B: 各组MIG水平比较; C: 各组TNF-α水平比较。与正常对照组比较, **P < 0.01, ***P < 0.001;
与病毒对照组比较, #P < 0.05, ###P < 0.001。pg/g表示每克(g)肺组织中炎症因子(pg)水平。3. 讨论
禽类是甲型流感的主要宿主，其中H9N2亚型AIV是当前禽类主要的流行亚型[18]。H9N2亚型AIV不仅可以直接跨种属感染包括人类在内的哺乳动物，还可以与其他流感病毒进行基因重组而产生新型流感病毒，引起世界范围内的大流行。自2013年起在中国流行多年的H7N9亚型禽流感病毒，其6个母核片段即全部来源于H9N2[19]。因此H9N2亚型AIV构成了临床和公共卫生的重大威胁[20-21]。病毒频繁变异降低了疫苗的时效性并增加了病毒对单分子纯化合药物的耐药概率[22]。尽管总体上奥司他韦仍是众多指南[23-26]推荐的抗流感病毒的首选药物，但频繁变异的流感病毒可因不同的机制对奥司他韦、金刚烷胺等产生耐药。抗流感中药的可能作用机制为: 一方面，抗病毒中药具有直接的抗病毒作用，通过多靶点作用抑制病毒的复制; 另一方面，抗病毒中药可调节机体的免疫、抗炎功能，改善机体抗病毒的反应程度及患者的症状[27-28]。因此，抗病毒中药在治疗包括禽流感在内的流感方面具有化学药物所不具备的独特优势。
包括双黄连在内的多种中药或中成药在治疗流感病毒上显示出良好的疗效，但其注射剂型导致不良反应甚至死亡的问题也屡见报道[29-30]。与口服、肌肉注射和静脉给药等方式相比，雾化吸入疗法因药物直接作用于靶器官而具有起效迅速、疗效佳、全身不良反应少、不需要患者刻意配合等优势，在国内外已被广泛应用[31]。中药雾化在治疗皮肤、呼吸道疾病方面应用较为广泛，包括慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸道感染等[32-35]。目前双黄连抗H9N2亚型AIV的研究，尤其是以雾化吸入给药治疗AIV感染的研究较少。本研究结果表明，双黄连雾化给药可改善小鼠肺指数，降低肺病毒滴度，减轻肺病理炎症，雾化给药的疗效良好。在临床实践中，双黄连雾化给药在治疗肺部感染、呼吸道感染(包括咽喉炎、扁桃体炎和细支气管炎等)等方面表现出较好的疗效[1, 5-6, 36]。
与SHL Ip组比较时, SHL Inh组肺指数较高，但在肺病毒滴度和肺病理炎症表现上效果相当。本研究中，用于雾化的药液浓度较低，可能是影响SHL Inh组在肺指数上未能达到SHL Ip组疗效的原因。双黄连注射给药虽具有全身药物浓度较高的优点，但其注射相关不良反应也在一定程度上限制了药物的临床应用[37]。另外，中药注射剂通常需要较多液体配置，以某种双黄连注射用粉剂(600 mg/支)为例，其推荐配置液体用量需要500 mL, 对于心肾功能不全的患者而言，过多的液体将会加重心肾负担。因此，虽然双黄连雾化吸入抗病毒效果不及注射给药，但雾化吸入给药无需静脉穿刺，液体负荷低，同时无输液相关不良反应，对于心肾功能不全、过敏体质等患者，仍具有重要的补充和替代作用。
与既往双黄连抗H9N2禽流感动物实验研究相似，本研究也证实双黄连可减轻肺部炎症，降低肺指数和肺病毒滴度。在肺炎症因子表达上，本研究中SHL Ip组肺组织炎症因子IL-6表达水平降低，而SHL Inh组IL-6表达水平未降低，可能与雾化吸入浓度降低有关。在SHL Ip组和SHL Inh组中，肺组织MIG和TNF-α表达水平较病毒对照组降低，但差异无统计学意义(P>0.05), 可能与小鼠样本量较小有关。当然，本研究也存在不足之处，例如在实验模型中，本研究未能测定双黄连气雾、小鼠肺组织和血液中药物的浓度，因此无法在药代动力学上更好地解释药物对感染小鼠的疗效，后续实验中需加强此方面的研究。
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图 1 TCGA数据库分析胶质瘤中GPIHBP1的表达水平
A: GPIHBP1在高级别、低级别胶质瘤中与正常组织的差异; B: 胶质瘤患者生存曲线; C: GPIHBP1表达差异与免疫浸润的关系。
两者比较, **P＜0.01, ***P＜0.001。![]()
图 2 胶质瘤患者GPIHBP1表达水平及其与免疫浸润的关系
A: IHC(放大400倍)实验检测GPIHBP1在低级别胶质瘤组织临床样本中高表达，阳性结果使用红色箭头标注; B: IHC(放大200倍)实验检测IBA1在高级别胶质瘤组织临床样本中高表达。IBA1是一种小胶质细胞或巨噬细胞特异的钙结合蛋白，阳性结果使用红色箭头标注。两者比较, **P＜0.01, ***P＜0.001。
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图 3 Western blot分析过表达GPIHBP1后胶质瘤细胞中GPIHBP1的表达
GL261、U87胶质瘤细胞过表达oe GPIHBP1后检测GPIHBP1蛋白的表达, *P＜0.05, ***P＜0.001。
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图 4 CCK-8与流式细胞术检测过表达GPIHBP1时GL261与U87胶质瘤细胞增殖、凋亡情况
A、B: CCK-8与流式细胞术检测过表达GPIHBP1时, GL261与U87胶质瘤细胞增殖减少; C: 凋亡试剂盒检测过表达GPIHBP1时, GL261细胞晚期凋亡增加，总体凋亡增加; U87细胞晚期凋亡增加，总体凋亡增加。
两者比较, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001。![]()
图 5 细胞划痕与Transwell实验检测过表达GPIHBP1后GL261与U87胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力
A: 细胞划痕实验显示，过表达GPIHBP1的胶质瘤细胞迁移能力减弱; B、C: Transwell实验显示，过表达GPIHBP1的胶质瘤细胞迁移、侵袭能力减弱。两者比较, **P＜0.01, **P＜0.001。
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图 6 过表达GPIHBP1对肿瘤生长及巨噬细胞浸润的影响
A: 原位荷瘤的小鼠活体成像显示，过表达GPIHBP1时肿瘤生长减慢; B: 皮下移植瘤显示，过表达GPIHBP1时肿瘤生长减慢; C: 小鼠原位荷瘤的脑片IF(放大200倍)检测Ki67与IBA1表达水平显示，过表达GPIHBP1时肿瘤增殖及巨噬细胞浸润较control少。D: 小鼠原位荷瘤的脑片IF(放大200倍)检测IBA1与INOS和ARG1共定位情况显示，过表达GPIHBP1时小胶质细胞中M1型增多, M2型减少; E: 小鼠皮下移植瘤石蜡切片IHC(放大200倍)实验显示，过表达GPIHBP1时，肿瘤增殖及巨噬细胞浸润较control少; F: 小鼠皮下移植瘤石蜡切片IF(放大200倍)实验检测F4/80与INOS和ARG1共定位情况显示，过表达GPIHBP1时巨噬细胞中M1型增多, M2型减少。F4/80是小鼠含生长因子样模体黏液样激素样受体(EMR1), 在巨噬细胞的成熟、活化过程中, F4/80蛋白表达发生显著变化。INOS: M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物; ARG1: M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物。两者比较, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001。
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