Expression of lysine oxidase in primary lesion of esophageal cancer and its effect on prognosis of patients with bone metastases based on bioinformatics
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摘要:目的
基于生物信息学探讨赖氨酸氧化酶(Lox)在食管癌(ESCA)原发灶及骨转移灶中的表达及临床意义。
方法通过癌症基因组图谱(TCGA)及基因表达谱分析互动平台(GEPIA)数据库筛选ESCA与正常食管组织中差异表达的基因。筛选2016年1月—2020年12月河北医科大学第四医院收治的食管癌手术患者的随访信息, 收集在随访过程中确诊骨转移患者的临床资料。应用蛋白免疫印迹(Western blot)验证Lox在ESCA及正常食管组织中的表达; 通过免疫组化染色检测人ESCA组织、正常组织中Lox的表达; 应用Kaplan-Meier曲线及Cox回归探索Lox的表达对于生存期的影响。
结果对GEPIA及TCGA数据库有关ESCA数据分析发现, Lox在ESCA病灶中的表达高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05); 应用京都基因与基因组百科全书(KEGG)及基因富集分析(GO)发现, Lox可能参与多种信号通路的信息传导; Western blot结果显示，癌组织中Lox表达高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05); 对随访资料的分析发现, Lox高表达患者更倾向于发生多发骨转移; 生存分析发现Lox高表达患者无骨转移生存期和总生存期短于Lox低表达的患者，差异有统计学意义(P<0.05); Cox回归发现Lox是食管癌骨转移患者预后的独立危险因素。
结论Lox在ESCA中呈高表达，并与临床预后相关，其可作为ESCA诊断及治疗的有效靶点。
Abstract:ObjectiveTo explore the expression and clinical significance of lysine oxidase (Lox) in primary lesion of esophageal carcinoma (ESCA) and bone metastasis lesion based on bioinformatics.
MethodsThe Cancer Genome Atlas (TCGA) and Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) databases were used to screen for differentially expressed genes between ESCA and normal esophageal tissues. Follow-up information of patients with surgery for esophageal cancer in the Fourth Hospital of Hebei Medical University from January 2016 to December 2020 were screened, and the clinical materials of patients diagnosed as bone metastasis during the follow-up period were collected. Western blot was used to verify the expression of Lox in ESCA and normal esophageal tissues; immunohistochemical staining was used to detect the expression of Lox in human ESCA tissue and normal tissue; the impact of Lox expression on survival was explored by Kaplan-Meier curve and Cox regression.
ResultsThrough the analysis of ESCA data in GEPIA and TCGA databases, it was found that the expression of Lox in ESCA lesions was significantly higher than that in normal tissues (P<0.05); the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO) enrichment analyses found that Lox may be involved in the information conduction of various signaling pathways; the Western blot result showed that the expression of Lox in cancer tissue was higher than that in adjacent normal tissue (P<0.05); the analysis of follow-up data found that patients with high expression of Lox were more likely to have multiple bone metastases; survival analysis revealed that patients with high Lox expression had significantly shorter bone metastasis free survival and overall survival compared to patients with low Lox expression (P<0.05); Cox regression found that Lox was an independent risk factor for prognosis of patients with esophageal cancer bone metastasis.
ConclusionLox is highly expressed in ESCA and significantly related to clinical prognosis, which can be used as an effective target for the diagnosis and treatment of ESCA.
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Keywords:
- lysine oxidase /
- esophageal carcinoma /
- tumor metastasis /
- bioinformatics /
- clinical prognosis
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食管癌(ESCA)为中国常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均位居前5位[1-2]。目前ESCA的治疗方式仍以外科治疗为主，随着医疗水平进步，分子靶向治疗逐步显现出较强的优势[3-6]。在临床免疫及分子靶向治疗过程中，特异性靶点的探索是针对性药物研发的重中之重，而何种靶向分子具有特异性且临床治疗安全有效则一直是科研人员不断探索的热点[7-10]。赖氨酸氧化酶(Lox)是肿瘤细胞微环境中调节细胞外基质(ECM)的一个重要因子，其可作用于ECM中胶原及弹性纤维的共价键交联，对ECM的发育、成熟及稳定有重要作用[11-13]。
近年来, Lox在肿瘤发生发展中的作用逐渐成为科研热点，但其具体机制仍未明确。目前，由于生物科学的技术进步，许多基于高通量测序技术的生物信息学数据被检测并上传到公共数据库中，而使用统计学和生物信息学等多学科联合的分析方法从中提取出可以预测患者预后状况的分子标志物以及与疾病发生发展有关的分子机制则是一种重要的解决方案[14]。本研究以生物信息学为基础，通过蛋白免疫印迹(Western blot)、免疫组化等方法探索Lox在ESCA以及骨转移中的作用，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 数据收集与初步筛选
通过基因表达谱分析互动平台(GEPIA)网站[15](http://gepia.cancer-pku.cn/)筛选ESCA癌症组织与正常组织中表达差异有意义的基因，通过下载肿瘤与癌症基因组图谱(TCGA)中ESCA数据库并进行差异表达基因分析。
1.2 基因功能富集分析
以Lox表达平均值进行高低分组，通过基因集富集分析(GSEA)探索Lox在ESCA中参与的通路及生物学进程。
1.3 临床资料收集
选取2016年1月—2020年12月收治的食管癌患者为研究对象。纳入标准: ①经临床、影像和病理检查确诊为食管癌者; ②行食管癌手术治疗者; ③随访过程中确诊骨转移者。排除标准: ①仅有临床、影像证据，无明确病理诊断者; ②不能排除骨原发肿瘤、结核病者。收集指标包括一般人口学特征(性别、年龄、体质量指数)、食管癌部位、病理、骨转移灶部位、治疗方式、无骨转移生存时间、总生存期和生存状态。通过门诊、电话及查阅住院病历获取患者信息。
1.4 Western blot验证Lox在食管癌病灶及正常组织中的表达
① 提取组织或细胞蛋白; ②测定蛋白质水平; ③电泳，条件设定为恒压120 V, 待染料前沿移行到距离凝胶底部4~5 mm时停止(约180 min); ④电转膜仪转膜，转膜条件为恒流250 mA, 2 h; ⑤封闭, 5%脱脂牛奶室温封闭2 h; ⑥加一抗，一抗封膜后室温条件下摇1 h, 然后放入4 ℃冰箱中过夜[Lox, 美国Abcam公司, No. ab174316, 用磷酸盐缓冲液(PBS)按照1∶300的稀释比例稀释]; ⑦收一抗, PBS加Tween-20(PBST)洗膜3次, 10 min/次; ⑧二抗孵育1 h(β-actin, 美国Abcam公司, No. ab179467，用PBS按照1∶500的稀释比例稀释); ⑨洗膜, PBST洗膜5次, PBS洗膜1次, 8 min/次; ⑩显色。
1.5 免疫组化染色以及病理结果评价及判定
通过对93例石蜡包埋ESCA组织进行切片，应用免疫组织化学方法将Lox染色，实验前蜡块处理、切片，抗原修复及染色过程均相同，二氨基联苯胺(DAB)显色后立刻用苏木精将细胞核染色，氨水返蓝于质量分数为75%、85%、95%、100%酒精中浸泡切片10 min, 进行脱水，将切片放入二甲苯中浸泡10 min取出，切片、封片。
1.6 统计学方法
采用R语言、SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0统计软件进行数据分析，计数资料以(x±s)描述，组间比较采用χ2检验。生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，差异比较采用Log-rank检验，分析2组患者的总生存期(OS)。采用Cox回归比例风险模型分析Lox表达与患者预后的关系，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 生物信息学分析
将TCGA与基因型组织表达数据库(GTEx)数据下载后标准化，利用R语言进行Lox表达量分析发现，肿瘤组织中Lox呈高表达，与正常食管组织比较，差异有统计学意义(P<0.001); 根据差异基因的表达量绘制差异最显著的前9位基因以及Lox热图，结果显示Lox在食管癌患者肿瘤病灶中高于正常食管组织。见图 1。
2.2 GSEA富集分析
在GSEA富集分析中，以Lox表达平均值进行高低分组，富集分析发现Lox高表达可参与“KEGG-Basl cell carcinoma”“KEGG-mTOR signaling pathway”“KEGG-P53 signaling pathway”“KEGG-VEGF signaling pathway”“KEGG-WNT signaling pathway”的进程，差异有统计学意义(P<0.05), 这为进一步探索Lox参与的相关通路提供了重要依据。见图 2。
2.3 临床资料
共有93例患者符合纳入标准，男64例，女29例; 原发灶病理类型为鳞癌63例(67.7%), 腺癌24例(25.8%), 其他6例(6.5%); 发病部位为上段15例(16.1%), 中段56例(60.2%), 下段22例(23.7%); 食管癌接受同步放化疗者40例(43.0%), 未接受同步放化疗者53例(57.0%); 单处骨转移者47例(50.5%), 多发骨转移者46例(49.5%)。见表 1。
表 1 ESCA患者临床资料及Lox表达情况(x±s)临床资料 分类 n Lox表达 P 低表达(n=42) 高表达(n=51) 年龄/岁 66.0±8.5 65.0±11.5 0.708 性别 男 64 28 36 0.685 女 29 14 15 发病部位 上段 15 2 13 0.026 中段 56 29 27 下段 22 11 11 病理类型 鳞癌 63 30 33 0.677 腺癌 24 9 15 其他 6 3 3 脊柱转移 是 65 28 37 0.538 否 28 14 14 骨转移数目 单发 47 29 18 0.001 多发 46 13 33 2.4 Western blot
Western blot实验结果显示, ESCA正常组织中Lox表达低于肿瘤组织，见图 3。
2.5 免疫组化染色
收集患者临床病理资料，对ESCA组织及正常组织进行免疫组化染色，结果显示ESCA组织中Lox高表达患者51例，正常组织中Lox高表达者22例; 结合随访资料发现，高表达Lox的患者更倾向于多发骨转移，差异有统计学意义(P<0.05)。见图 4。
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图 4 ESCA组织及其骨转移灶中Lox的表达A: 正常食管HE染色; B: 正常食管中Lox低表达; C: ESCA患者食管癌HE染色; D: ESCA食管癌病灶中Lox高表达。2.6 GEPIA数据库生存分析
GEPIA数据库分析显示, ESCA病灶中高表达Lox的患者较低表达Lox的患者的OS缩短，差异有统计学意义(PLog-ran k=0.047, HR=1.6), 但无病生存期(DFS)无显著差异，见图 5。
2.7 随访生存分析及Cox多因素分析
Lox低表达组与Lox高表达组无骨转移生存期及OS比较，差异有统计学意义(P<0.05), 见图 6。Lox低表达组1、2、3年的总生存率分别为77.9%、62.9%、33.1%, Lox高表达组分别为67.2%、12.2%、6.1%。多因素Cox分析显示, Lox表达是ESCA骨转移患者预后的独立影响因素(HR=1.770, 95%CI: 1.016~3.085, P=0.044), 见表 2。
表 2 ESCA患者预后的多因素Cox回归分析因素 β HR(95%CI) P 年龄 -0.017 0.983(0.961~1.006) 0.140 性别 0.722 2.058(1.104~3.839) 0.023 体质量指数 -0.030 0.970(0.896~1.051) 0.460 原发部位 0.249 1.283(0.800~2.056) 0.301 骨转移灶是否手术 0.652 1.919(1.080~3.409) 0.026 病理类型 0.179 1.196(0.777~1.842) 0.415 是否脊柱转移 0.261 1.299(0.716~2.354) 0.389 是否单发转移 -0.659 0.517(0.299~0.896) 0.019 原发灶是否同步放化疗 -0.804 0.448(0.250~0.802) 0.007 Lox表达量 0.571 1.770(1.016~3.085) 0.044 3. 讨论
研究[16-17]显示, ECM对肿瘤的发生发展起着不可或缺的作用。ECM是肿瘤微环境中最重要的组成部分，其承载肿瘤细胞周围的养分供应、免疫细胞浸润等不同职能[18-19]。Lox家族是一组分泌型铜依赖性胺氧化酶，其主要功能是催化ECM中胶原蛋白、弹性蛋白的共价交联，对ECM发育、成熟、修复及稳定起重要作用。研究[20-21]显示, Lox可以调节胰腺癌细胞侵袭转移的能力，高表达Lox的胰腺癌细胞具有更强的侵袭及转移能力，其肿瘤异质性的增强可能与自噬、EMT、抗凋亡、促进细胞增殖有关[22-23]。研究[24-25]显示，三阴性乳腺癌中Lox表达更高，低表达Lox可降低乳腺癌患者骨转移的发生率，低表达Lox的患者较高表达Lox的患者OS更高。GONZÁLEZ-CHAVARRÍA I等[26]研究发现, Lox-1与基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达呈正相关，高表达Lox-1可明显增强肿瘤的恶性程度。NILSSON M等[27]研究发现，高表达Lox可使非恶性前列腺上皮转变为前列腺癌，显著影响患者临床预后。本研究中，高表达Lox与食管癌骨转移呈正相关，这与既往研究[28-30]显示Lox是促进转移的主要因素的结论相符合，这也从侧面提示抑制Lox可以作为免疫治疗的新研究方向。
肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的过程，骨是肿瘤转移的重要部位，约10%的癌症患者和40%的已知转移性骨病患者将出现症状性骨转移。一旦癌症扩散到骨骼，就很难治愈，其会导致疼痛、病理性骨折、高钙血症及神经压迫等骨相关事件的发生。本研究针对Lox在食管癌中的作用进行了初步的探索，通过生物信息学结合实验研究发现, Lox对于提高ESCA的侵袭转移能力有较强的作用，在大数据分析的基础上探索发现高表达Lox可能参与“KEGG-Basl cell carcinoma”“KEGG-mTOR signaling pathway”“KEGG-P53 signaling pathway”“KEGG-VEGF signaling pathway”“KEGG-WNT signaling pathway”的进程。尽管GEPIA数据库分析显示Lox的表达对于DFS无显著影响，但临床随访资料显示Lox高表达可显著降低患者无骨转移生存率及OS, 进一步证实Lox是预测食管癌患者OS的重要影响因素。
综上所述，本研究以生物信息学为基础，探索了Lox在食管癌中的表达，利用GSEA富集分析初步探索了Lox在食管癌发生发展中的相关通路，结合GEPIA及随访资料进行生存分析发现Lox可能是影响食管癌患者骨转移及预后的重要因素。
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图 4 ESCA组织及其骨转移灶中Lox的表达
A: 正常食管HE染色; B: 正常食管中Lox低表达; C: ESCA患者食管癌HE染色; D: ESCA食管癌病灶中Lox高表达。
表 1 ESCA患者临床资料及Lox表达情况(x±s)
临床资料 分类 n Lox表达 P 低表达(n=42) 高表达(n=51) 年龄/岁 66.0±8.5 65.0±11.5 0.708 性别 男 64 28 36 0.685 女 29 14 15 发病部位 上段 15 2 13 0.026 中段 56 29 27 下段 22 11 11 病理类型 鳞癌 63 30 33 0.677 腺癌 24 9 15 其他 6 3 3 脊柱转移 是 65 28 37 0.538 否 28 14 14 骨转移数目 单发 47 29 18 0.001 多发 46 13 33 
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表 2 ESCA患者预后的多因素Cox回归分析
因素 β HR(95%CI) P 年龄 -0.017 0.983(0.961~1.006) 0.140 性别 0.722 2.058(1.104~3.839) 0.023 体质量指数 -0.030 0.970(0.896~1.051) 0.460 原发部位 0.249 1.283(0.800~2.056) 0.301 骨转移灶是否手术 0.652 1.919(1.080~3.409) 0.026 病理类型 0.179 1.196(0.777~1.842) 0.415 是否脊柱转移 0.261 1.299(0.716~2.354) 0.389 是否单发转移 -0.659 0.517(0.299~0.896) 0.019 原发灶是否同步放化疗 -0.804 0.448(0.250~0.802) 0.007 Lox表达量 0.571 1.770(1.016~3.085) 0.044
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[1] YAO R, ZHANG T C, ZHANG J, et al. Effects of postoperative enteral nutrition combined with adjuvant radiotherapy on inflammatory response, nutrition, healing and prognosis in patients receiving radical surgery for esophageal carcinoma[J]. J BUON, 2019, 24(4): 1673-1678.
[2] LUO H, SONG H L, MAO R H, et al. Targeting valosin-containing protein enhances the efficacy of radiation therapy in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Sci, 2019, 110(11): 3464-3475. doi: 10.1111/cas.14184
[3] MIMURA K, YAMADA L, UJⅡE D, et al. Immunotherapy for esophageal squamous cell carcinoma: a review[J]. Fukushima J Med Sci, 2018, 64(2): 46-53. doi: 10.5387/fms.2018-09
[4] LAM K O, KWONG D L W. Target therapy for esophageal adenocarcinoma[J]. Methods Mol Biol, 2018, 1756: 51-65.
[5] LIU K C, XIE F A, ZHAO T T, et al. Targeting SOX2 protein with peptide aptamers for therapeutic gains against esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Ther, 2020, 28(3): 901-913. doi: 10.1016/j.ymthe.2020.01.012
[6] GAO T T, SHAN J H, YANG Y X, et al. Comparative efficacy and safety of immunotherapy for patients with advanced or metastatic esophageal squamous cell carcinoma: a systematic review and network Meta-analysis[J]. BMC Cancer, 2022, 22(1): 992. doi: 10.1186/s12885-022-10086-5
[7] HORISBERGER A, ROSA S L, ZURCHER J P, et al. A severe case of refractory esophageal stenosis induced by nivolumab and responding to tocilizumab therapy[J]. J Immunother Cancer, 2018, 6(1): 156. doi: 10.1186/s40425-018-0481-0
[8] LI Y, LU Z L, CHE Y, et al. Immune signature profiling identified predictive and prognostic factors for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Oncoimmunology, 2017, 6(11): e1356147. doi: 10.1080/2162402X.2017.1356147
[9] ILSON D H, VAN HILLEGERSBERG R. Management of patients with adenocarcinoma or squamous cancer of the esophagus[J]. Gastroenterology, 2018, 154(2): 437-451. doi: 10.1053/j.gastro.2017.09.048
[10] XUE M Y, TONG Y S, XIONG Y Z, et al. Role of cancer-associated fibroblasts in the progression, therapeutic resistance and targeted therapy of oesophageal squamous cell carcinoma[J]. Front Oncol, 2023, 13: 1257266. doi: 10.3389/fonc.2023.1257266
[11] KALIKAWE R, BABA Y, NOMOTO D, et al. Lysyl oxidase impacts disease outcomes and correlates with global DNA hypomethylation in esophageal cancer[J]. Cancer Sci, 2019, 110(12): 3727-3737. doi: 10.1111/cas.14214
[12] NAZEMI M, RAINERO E. Cross-talk between the tumor microenvironment, extracellular matrix, and cell metabolism in cancer[J]. Front Oncol, 2020, 10: 239. doi: 10.3389/fonc.2020.00239
[13] LI S Y, SAMPSON C, LIU C H, et al. Integrin signaling in cancer: bidirectional mechanisms and therapeutic opportunities[J]. Cell Commun Signal, 2023, 21(1): 266. doi: 10.1186/s12964-023-01264-4
[14] JVNEMANN S, KLEINBÖLTING N, JAENICKE S, et al. Bioinformatics for NGS-based metagenomics and the application to biogas research[J]. J Biotechnol, 2017, 261: 10-23. doi: 10.1016/j.jbiotec.2017.08.012
[15] TANG Z F, LI C W, KANG B X, et al. GEPIA: a web server for cancer and normal gene expression profiling and interactive analyses[J]. Nucleic Acids Res, 2017, 45(W1): W98-W102. doi: 10.1093/nar/gkx247
[16] HENKE E, NANDIGAMA R, ERGVN S. Extracellular matrix in the tumor microenvironment and its impact on cancer therapy[J]. Front Mol Biosci, 2019, 6: 160.
[17] FLIES D B, LANGERMANN S, JENSEN C, et al. Regulation of tumor immunity and immunotherapy by the tumor collagen extracellular matrix[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1199513. doi: 10.3389/fimmu.2023.1199513
[18] TENTI P, VANNUCCI L. Lysyl oxidases: linking structures and immunity in the tumor microenvironment[J]. Cancer Immunol Immunother, 2020, 69(2): 223-235. doi: 10.1007/s00262-019-02404-x
[19] FEJZA A, CAROBOLANTE G, POLETTO E, et al. The entanglement of extracellular matrix molecules and immune checkpoint inhibitors in cancer: a systematic review of the literature[J]. Front Immunol, 2023, 14: 1270981. doi: 10.3389/fimmu.2023.1270981
[20] MA W D, LI T, WU S, et al. Lox and ACSL5 as potential relapse markers for pancreatic cancer patients[J]. Cancer Biol Ther, 2019, 20(6): 787-798. doi: 10.1080/15384047.2018.1564565
[21] ZHANG J, ZHANG L, LI C, et al. Lox-1 is a poor prognostic indicator and induces epithelial-mesenchymal transition and metastasis in pancreatic cancer patients[J]. Cell Oncol, 2018, 41(1): 73-84. doi: 10.1007/s13402-017-0360-6
[22] WANG T H, HSIA S M, SHIEH T M. Lysyl oxidase and the tumor microenvironment[J]. Int J Mol Sci, 2016, 18(1): 62. doi: 10.3390/ijms18010062
[23] RADICJ, KOŽIK B, NIKOLICI, et al. Multiple roles of LOXL2 in the progression of hepatocellular carcinoma and its potential for therapeutic targeting[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(14): 11745. doi: 10.3390/ijms241411745
[24] LEO C, COTIC C, POMP V, et al. Overexpression of Lox in triple, MNBVCXZ-negative breast cancer[J]. Ann Diagn Pathol, 2018, 34: 98-102. doi: 10.1016/j.anndiagpath.2018.03.009
[25] PUCCI S, POLIDORO C, GREGGI C, et al. Pro-oncogenic action of Lox-1 and its splice variant Lox-1Δ4 in breast cancer phenotypes[J]. Cell Death Dis, 2019, 10(2): 53. doi: 10.1038/s41419-018-1279-1
[26] GONZÁLEZ-CHAVARRÍA I, FERNANDEZ E, GUTIERREZ N, et al. Lox-1 activation by oxLDL triggers an epithelial mesenchymal transition and promotes tumorigenic potential in prostate cancer cells[J]. Cancer Lett, 2018, 414: 34-43. doi: 10.1016/j.canlet.2017.10.035
[27] NILSSON M, HÄGGLÖF C, HAMMARSTEN P, et al. H igh lysyl oxidase (Lox) in the non-malignant prostate epithelium predicts a poor outcome in prostate cancer patient managed by watchful waiting[J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0140985. doi: 10.1371/journal.pone.0140985
[28] TSUMITA T, MAISHI N, ANNAN D A M, et al. The oxidized-LDL/Lox-1 axis in tumor endothelial cells enhances metastasis by recruiting neutrophils and cancer cells[J]. Int J Cancer, 2022, 151(6): 944-956.
[29] LACZKO R, CSISZAR K. Lysyl oxidase (Lox): functional contributions to signaling pathways[J]. Biomolecules, 2020, 10(8): 1093.
[30] JOHNSTON K A, LOPEZ K M. Lysyl oxidase in cancer inhibition and metastasis[J]. Cancer Lett, 2018, 417: 174-181.
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