Performance and application of droplet digital polymerase chain reaction in rapid diagnosis of bloodstream infections
-
摘要:目的
使用临床菌株和标准菌株验证微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)试剂检测性能，并评估ddPCR技术临床应用的有效性和实用性。
方法使用临床菌株和标准菌株验证ddPCR试剂盒符合率、特异度、精密度、最低检出限等。收集74例疑似血流感染患者的血液样本，同时采用ddPCR和血培养2种方法测定患者血液标本的病原体。
结果ddPCR血流感染病原体检测的平均检测时间为3.5 h, 能够同时检测十几种常见病原体, ddPCR血流感染病原体检测试剂盒的符合率、特异度、精密度、最低检测限均满足临床要求。疑似血流感染的74例患者中，采用ddPCR方法检测的阳性率为64.86%, 采用血培养检测的阳性率为40.54%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论ddPCR可快速﹑批量﹑高效地检测血流感染常见病原体，检测性能可以满足临床需要，血培养联合ddPCR技术检测血流感染有利于临床血流感染患者的早期快速诊断。
-
关键词:
- 微滴式数字聚合酶链式反应 /
- 血流感染 /
- 血培养 /
- 病原体
Abstract:ObjectiveTo validate the performance of droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) reagents using clinical and standard strains, and to evaluate the effectiveness and practicability of ddPCR technology in clinical applications.
MethodsThe concordance rate, specificity, precision, and lower limit of detection of the ddPCR kit were validated using clinical and standard strains. Blood samples from 74 patients with suspected bloodstream infections were collected, and both ddPCR and blood culture methods were used to determine the pathogens in the patient's blood samples.
ResultsThe average detection time of ddPCR for pathogens of bloodstream infection was 3.5 hours, which was able to complete the detection of over a dozen common pathogens simultaneously. The concordance rate, specificity, precision, and lower limit of detection of the ddPCR kit for bloodstream infection pathogens all met clinical requirements. Among the 74 patients with suspected bloodstream infections, the positive detection rate using the ddPCR method was 64.86%, while was 40.54% using blood culture, with a statistically significant difference (P < 0.05).
ConclusionThe method of ddPCR can detect common pathogens of bloodstream infections rapidly, efficiently, and in large quantities, and its main detection performance can meet clinical needs. The combination of blood culture and ddPCR technology is conductive to early and rapid diagnosis of clinical bloodstream infection patients.
-
胃癌的早期症状不显著，极易被忽视，多数患者确诊时病情已进展至中晚期[1], 有效评估肿瘤进展对改善胃癌患者预后具有重要意义[2]。胃镜检查和病理组织学检查是目前诊断胃癌和评估病情的主要手段，但其费用高、具有侵袭性，且需专业人员操作，临床应用受限[3]。血清肿瘤标志物检测因其无创性和高灵敏度，已逐渐被广泛用于胃癌的早期诊断和预后评估中。血清糖类抗原72-4(CA72-4)、鳞癌相关抗原(SCC)和胃泌素释放肽前体(ProGRP)均为临床常用的肿瘤标志物，对多种恶性肿瘤具有辅助诊断和预后评估价值[4]。CA72-4是一种血清糖类抗原，已被广泛用于胃癌检测。SCC常被用于鳞状细胞癌的诊断，但其在胃癌中的表达及临床意义仍有待深入探讨[5]。ProGRP广泛存在于胃肠道组织中，并在血液中稳定表达，对肿瘤进展有重要影响[6]。本研究分析血清ProGRP、SCC、CA72-4水平与胃癌淋巴结转移、组织学分级等病理参数的关系及其对患者随访期间死亡的预测价值，以期为胃癌的早期诊断和预后评估提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取滁州市第一人民医院收治的68例胃癌患者(胃癌组)、37例胃部良性病变患者(胃部良性病变组)和30例健康受试者(非胃部疾病组)作为研究对象。胃癌组和胃部良性病变组纳入标准: ①符合原发性胃癌诊断标准[7], 无其他部位恶性肿瘤，入院前未接受放放疗、化疗等胃癌系统性治疗者(胃癌组); ②经病理检查排除恶性肿瘤者(胃部良性病变组); ③年龄>18岁，首次患病者; ④自愿参与本研究并签署知情同意书者; ⑤临床资料、随访资料完整且可靠者。非胃部疾病组纳入标准: 年龄>18岁，无免疫系统疾病、血液疾病，无心、肝、肾功能障碍及恶性肿瘤者。排除标准: ①因精神异常、智力障碍等无法配合研究者; ②重要脏器功能异常者; ③哺乳期及妊娠期妇女; ④合并幽门螺杆菌感染、免疫性疾病、血液系统疾病者; ⑤合并结直肠炎、肾衰竭、肝炎等疾病者; ⑥研究开始前服用免疫抑制剂、激素类药物者。
胃癌组男42例、女26例，平均年龄(51.20± 10.35)岁，体质量指数(BMI)为(22.10±2.13) kg/m2, 胃癌分型为腺癌49例、鳞癌13例、腺鳞癌5例、印戎细胞癌1例, TNM分期为Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期14例; 胃部良性病变组男20例、女17例，平均年龄(48.26±8.67)岁，BMI为(21.89±2.08) kg/m2, 疾病类型为萎缩性胃炎13例、浅表性胃炎8例、胃息肉9例、胃溃疡7例; 非胃部疾病组男19例、女11例，平均年龄(49.35±9.64)岁, BMI为(22.02±2.27) kg/m2。3组研究对象性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经滁州市第一人民医院伦理委员会审核批准。
1.2 方法
1.2.1 血清学指标检测
所有研究对象入院后留取4 mL清晨空腹外周静脉血, 3 500 r/min高速离心10 min(离心半径10 cm), 留取上清。应用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析系统，以电化学发光法检测血清ProGRP、SCC、CA72-4水平，检测过程严格遵守相关操作要求。
1.2.2 预后随访
对出院后胃癌组患者进行微信随访和电话随访，随访时间24个月，记录患者随访期间存活和死亡情况。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，计量资料以(x±s)表示, 2组比较采用独立样本t检验, 3组间比较采用单因素方差分析，采用Bonferroni校正法进行组间两两比较; 计数资料以[n(%)]表示，比较采用χ2检验; 采用多因素Logistic回归分析明确胃癌患者随访预后的影响因素，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血清ProGRP、SCC、CA72-4水平单独及联合检测对胃癌患者随访期间死亡的预测价值，计算曲线下面积(AUC)及最佳截断值, AUC比较采用Delong检验; 所有检验均为双侧检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 3组入院时血清学指标水平比较
3组间血清ProGRP、SCC、CA72-4水平比较，差异有统计学意义(F=343.459、310.041、825.479, P < 0.001); 胃癌组血清ProGRP、SCC、CA72-4水平高于胃部良性病变组、非胃部疾病组，胃部良性病变组血清ProGRP、CA72-4水平高于非胃部疾病组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 3组入院时血清学指标水平比较(x±s)组别 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) 胃癌组 68 226.35±50.68*# 3.08±0.63*# 31.08±5.46*# 胃部良性病变组 37 105.27±20.19* 1.02±0.32 4.05±0.72* 非胃部疾病组 30 20.33±3.67 0.95±0.20 3.26±0.53 ProGRP: 胃泌素释放肽前体; SCC: 鳞癌相关抗原; CA72-4: 糖类抗原72-4。与非胃部疾病组比较, * P < 0.05;
与胃部良性病变组比较, #P < 0.052.2 胃癌组血清学指标与临床病理参数的关系
胃癌组中, TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织学分级为中低分化、有淋巴结转移患者血清ProGRP、CA72-4水平分别高于Ⅰ~Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P < 0.05); 组织学分级为中低分化患者血清SCC水平高于高分化患者，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 胃癌组患者血清学指标与临床病理参数的关系分析(x±s)病理参数 分类 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) TNM分期 Ⅰ~Ⅱ期 28 210.28±40.62 2.95±0.36 25.45±4.10 Ⅲ~Ⅳ期 40 237.60±52.35* 3.17±0.64 35.02±6.02* 组织学分级 高分化 33 208.54±36.48 2.91±0.58 27.25±5.32 中低分化 35 243.14±50.79* 3.24±0.70* 34.69±4.67* 淋巴结转移 无 54 217.78±45.15 3.02±0.49 27.96±3.05 有 14 259.40±53.16* 3.31±0.63 43.11±6.08* 与同一病理参数中的另一类比较, * P < 0.05。 2.3 不同预后胃癌患者入院时血清学指标水平比较
随访24个月时，胃癌组患者存活49例(72.06%)、死亡19例(27.94%), 分别纳入存活组、死亡组。死亡组患者入院时血清ProGRP、SCC、CA72-4水平均高于存活组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 不同预后胃癌患者入院时血清学指标水平比较(x±s)组别 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) 存活组 49 218.60±43.25 2.82±0.47 23.50±5.39 死亡组 19 246.33±51.39* 3.18±0.65* 34.02±6.17* 与存活组比较, * P < 0.05。 2.4 胃癌患者随访预后的影响因素分析
以血清学指标水平(连续变量)为自变量，以随访预后(存活=0, 死亡=1)为因变量，进行多因素Logistic回归分析。分析结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4均为胃癌患者随访预后的独立影响因素(P < 0.05), 见表 4。
表 4 胃癌患者随访预后的多因素Logistic回归分析自变量 b SE Wald χ2 OR P 95%CI ProGRP 0.792 0.325 5.939 2.208 0.015 1.168~4.175 SCC 1.227 0.514 5.699 3.411 0.017 1.246~9.341 CA72-4 0.813 0.319 6.495 2.255 0.011 1.207~4.213 2.5 入院时血清学指标对胃癌患者随访期间死亡的预测价值
根据多因素Logistic回归分析结果建立联合预测模型: Logit(P)=-2.252+0.792(ProGRP)+ 1.227(SCC)+0.813(CA72-4), 其中P代表死亡概率。ROC曲线分析结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4水平对胃癌患者随访期间死亡均有良好的预测效能(AUC=0.766、0.705、0.828), 三者联合诊断的AUC为0.899, 大于ProGRP、SCC、CA72-4单独诊断的AUC(Z=2.455、3.492、4.932, P < 0.05), 见表 5、图 1。
表 5 入院时血清学指标对胃癌患者随访期间死亡的预测效能指标 AUC SE 最佳截断值 95%CI 灵敏度/% 特异度/% 约登指数 ProGRP 0.766 0.056 230.68 ng/L 0.656~0.876 94.70 57.10 0.518 SCC 0.705 0.064 2.94 ng/mL 0.581~0.830 75.70 65.30 0.410 CA72-4 0.828 0.052 29.235 μg/L 0.726~0.930 78.90 75.50 0.544 三者联合 0.899 0.039 — 0.824~0.975 73.60 89.80 0.634 3. 讨论
胃癌的发病率和致死率均较高，发病原因包括遗传、饮食习惯不良及接触致癌物质等[8-10]。精准预测胃癌患者的预后可为治疗策略的及时调整提供参考依据，进而保障疗效。影像学检查费用较高，在疾病早期易误诊、漏诊，且难以实现动态定量化随访。胃镜检查与组织病理学检查操作复杂，且检查过程中不适感强，部分患者存在抵触情绪。近年来，创伤小、灵敏度高的生物学指标辅助检测技术逐渐受到重视，血液肿瘤标志物水平可较好地反映肿瘤细胞增殖、浸润及迁移情况，为恶性肿瘤的临床诊疗提供依据。
糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原125(CA125)和癌胚抗原(CEA)是目前临床常用的肿瘤生物标志物，但其诊断早期胃癌的灵敏度较低，且CA19-9、CA125在胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，特异度不高。CA72-4是糖链蛋白家族成员之一，在癌细胞间的信号传递中发挥重要作用，可用于恶性肿瘤的早期辅助诊断。ProGRP是消化道分泌性细胞因子胃泌素释放肽(GRP)的前体结构，可作为胃癌的特异性标志物, GRP与特异性受体结合后，可刺激部分原癌基因转录，促进疾病进展[11]。SCC作为一种肿瘤标志物，多见于肿瘤进展期，可调控肿瘤细胞的凋亡过程。本研究发现，胃癌组血清ProGRP、SCC、CA72-4水平显著高于胃部良性病变组、非胃部疾病组，胃部良性病变组血清ProGRP、CA72-4水平显著高于非胃部疾病组。吴雨林等[12]发现SCC在胃癌低分化组织中呈高表达，张磊等[13]发现胃癌患者的血清CA72-4水平高于胃部良性疾病患者及健康者，且进展期胃癌患者的CA72-4水平高于早期胃癌患者，与本研究结论一致，提示SCC、CA72-4可能与胃癌的发生发展有关。
本研究发现，血清CA72-4、SCC、ProGRP水平与胃癌TNM分期、组织学分级和淋巴结转移状态有关。TNM分期系统中, Ⅰ~Ⅱ期肿瘤的主要特征是尚未侵犯或仅局部侵犯至淋巴结和/或邻近组织，Ⅲ~Ⅳ期肿瘤则已显著侵犯淋巴结和/或邻近组织，甚至出现远处转移。本研究中, TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织学分级为中低分化、有淋巴结转移胃癌患者血清ProGRP、CA72-4水平分别显著高于Ⅰ~Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，提示ProGRP、CA72-4可能与肿瘤的侵袭和转移能力有关，且肿瘤细胞在分化程度较低时可能更倾向于无序生长和侵袭。本研究还发现，不同TNM分期和不同淋巴结转移状态患者的血清SCC水平无显著差异，但不同组织学分级患者的血清SCC水平存在显著差异，表明SCC可能主要与肿瘤细胞的分化程度有关。
本研究结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4水平对胃癌患者随访期间死亡具有良好的预测效能，且三者联合的预测效能更佳。相较于侵入性病理组织学检查，血清生物标志物检测相对简单且无创，多个标志物联合检测可获取更全面的信息，从而更准确地预测患者的预后。相关研究[14]发现，胃癌患者血清ProGRP水平显著高于健康对照者，且与肿瘤直径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移显著相关, ROC曲线显示ProGRP、CA72-4联合诊断胃癌的效能高。既往研究[15]指出，胃癌患者生存期与ProGRP水平显著相关, ProGRP与胃蛋白酶原联合预测胃癌患者生存时间超过中位生存期的AUC为0.898。冯苗等[16]发现, CA72-4水平高于20 μg/L是胃癌患者预后不良的危险因素。本研究中, CA72-4预测患者随访期间死亡的截断值为29.235 μg/L, 与上述研究[16]结论相符。由此提示，血清ProGRP、CA72-4、SCC或可作为胃癌患者预后的预测因子。
综上所述，胃癌患者血清ProGRP、SCC、CA72-4水平显著高于胃部良性病变患者及健康受试者，且血清ProGRP、SCC、CA72-4水平与TNM分期、组织学分级、淋巴结转移状态有关，三者联合检测对患者随访期间死亡具有很好的预测效能。
-
表 1 反应液检测靶标
反应液 荧光通道 FAM VIC ROX CY5 CY5.5 ATTO 425 Panel 1 铜绿假单胞菌 大肠杆菌 肺炎克雷伯菌 鲍曼不动杆菌 — 内对照 Panel 2 金黄色葡萄球菌 念珠菌 肠球菌 链球菌 — 内对照 Panel 3 嗜麦芽窄食单胞菌 阴沟肠杆菌 奇异变形杆菌 凝固酶阴性葡萄球菌 黏质沙雷氏菌 内对照 FAM: 6-羧基荧光素; VIC: 四氯-6-羧基荧光素; ROX: 6-羧基-X-罗丹明; CY5: 花菁5琥珀酰胺酯;
CY5.5: 花菁5.5琥珀酰胺酯; ATTO 425: 425-N-羟基琥珀酰亚胺酯荧光标记物。
下载: 导出CSV
表 2 阴性和阳性符合率验证结果
拷贝数/μL 反应液 参考品 ROX VIC FAM CY5 CY5.5 Panel 1 Q1 346.145 711.445 505.808 789.063 — NTC 0.167 0.172 0.170 0.089 — PTC 163.079 330.158 256.671 455.681 — Panel 2 Q2 710.021 635.365 711.345 849.811 — NTC 0 0.090 0 0.070 — PTC 326.774 345.464 322.071 466.345 — Panel 3 Q3 544.613 735.356 678.775 625.857 803.323 NTC 0 0.080 0 0 0 PTC 298.218 367.484 345.547 327.391 348.685
下载: 导出CSV
表 3 Panel 1﹑Panel 2和Panel 3精密度验证结果
拷贝数/μL 测试 ROX CV%/% VIC CV%/% FAM CV%/% CY5 CV%/% CY5.5 CV%/% Panel l-1 546.234 5.54 678.993 2.70 687.118 5.05 872.557 1.87 — — Panel l-2 522.370 720.052 776.063 902.753 — Panel l-3 487.654 677.091 689.987 881.961 — Panel l-4 494.536 676.141 728.382 863.935 — Panel l-5 550.563 684.298 733.597 862.761 — Panel 2-1 709.563 1.65 646.094 3.80 768.370 2.68 893.268 3.42 — — Panel 2-2 706.429 595.455 759.962 895.266 — Panel 2-3 728.811 585.298 723.869 881.680 — Panel 2-4 706.702 608.454 773.710 954.517 — Panel 2-5 729.254 613.997 769.567 879.218 — Panel 3-1 559.235 2.61 735.263 2.49 678.148 3.02 619.124 1.24 789.859 1.36 Panel 3-2 567.256 733.128 684.124 612.147 788.124 Panel 3-3 547.388 728.452 671.458 626.458 802.125 Panel 3-4 529.256 718.479 672.140 624.158 811.476 Panel 3-5 548.259 767.220 632.850 632.685 809.851
下载: 导出CSV
表 4 2种检测方法定性结果比较[n(%)]
检测方法 阳性 阴性 χ2 P ddPCR 48(64.86) 26(35.14) 8.78 0.003 血培养 30(40.54) 44(59.46)
下载: 导出CSV
-
[1] KWIECINSKI J M, HORSWILL A R. Staphylococcus aureus bloodstream infections: pathogenesis and regulatory mechanisms[J]. Curr Opin Microbiol, 2020, 53: 51-60. doi: 10.1016/j.mib.2020.02.005
[2] LAMY B, SUNDQVIST M, IDELEVICH E A. Bloodstream infections-Standard and progress in pathogen diagnostics[J]. Clin Microbiol Infect, 2020, 26(2): 142-150. doi: 10.1016/j.cmi.2019.11.017
[3] FABRE V, CARROLL K C, COSGROVE S E. Blood culture utilization in the hospital setting: a call for diagnostic stewardship[J]. J Clin Microbiol, 2022, 60(3): e0100521. doi: 10.1128/jcm.01005-21
[4] MERINO I, DE LA FUENTE A, DOMÍNGUEZ-GIL M, et al. Digital PCR applications for the diagnosis and management of infection in critical care medicine[J]. Crit Care, 2022, 26(1): 63. doi: 10.1186/s13054-022-03948-8
[5] ABRAM T J, CHERUKURY H, OU C Y, et al. Rapid bacterial detection and antibiotic susceptibility testing in whole blood using one-step, high throughput blood digital PCR[J]. Lab Chip, 2020, 20(3): 477-489. doi: 10.1039/C9LC01212E
[6] WOUTERS Y, DALLOYAUX D, CHRISTENHUSZ A, et al. Droplet digital polymerase chain reaction for rapid broad-spectrum detection of bloodstream infections[J]. Microb Biotechnol, 2020, 13(3): 657-668. doi: 10.1111/1751-7915.13491
[7] 吴文娟, 李敏, 陈德昌. 血流感染临床检验路径专家共识[J]. 中华传染病杂志, 2022, 40(8): 457-475. doi: 10.3760/cma.j.cn311365-20220130-00033 [8] CNAS-GL039: 2019《分子诊断检验程序性能验证指南》[EB/OL]. (2019-02-15) [2023-06-01]. https://www.cnas.org.cn/images/rkgf/sysrk/rkzn/2019/04/04/EE941BDABEA79C7D6D9128A28852297C.pdf. [9] PLIAKOS E E, ANDREATOS N, SHEHADEH F, et al. The cost-effectiveness of rapid diagnostic testing for the diagnosis of bloodstream infections with or without antimicrobial stewardship[J]. Clin Microbiol Rev, 2018, 31(3): e00095-e00017.
[10] WANG D R, WANG S, DU X F, et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment[J]. Mol Ecol Resour, 2022, 22(7): 2587-2598. doi: 10.1111/1755-0998.13644
[11] LIESENFELD O, LEHMAN L, HUNFELD K P, et al. Molecular diagnosis of sepsis: new aspects and recent developments[J]. Eur J Microbiol Immunol, 2014, 4(1): 1-25. doi: 10.1556/EuJMI.4.2014.1.1
[12] OPOTA O, JATON K, GREUB G. Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood[J]. Clin Microbiol Infect, 2015, 21(4): 323-331. doi: 10.1016/j.cmi.2015.02.005
[13] HALLING K C, SCHRIJVER I, PERSONS D L. Test verification and validation for molecular diagnostic assays[J]. Arch Pathol Lab Med, 2012, 136(1): 11-13. doi: 10.5858/arpa.2011-0212-ED
[14] HU B C, TAO Y, SHAO Z Q, et al. A comparison of blood pathogen detection among droplet digital PCR, metagenomic next-generation sequencing, and blood culture in critically ill patients with suspected bloodstream infections[J]. Front Microbiol, 2021, 12: 641202. doi: 10.3389/fmicb.2021.641202
[15] ZHENG Y, JIN J, SHAO Z Q, et al. Development and clinical validation of a droplet digital PCR assay for detecting Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae in patients with suspected bloodstream infections[J]. Microbiologyopen, 2021, 10(6): e1247. doi: 10.1002/mbo3.1247
[16] WU J, TANG B, QIU Y Z, et al. Clinical validation of a multiplex droplet digital PCR for diagnosing suspected bloodstream infections in ICU practice: a promising diagnostic tool[J]. Crit Care, 2022, 26(1): 243. doi: 10.1186/s13054-022-04116-8
[17] LIN K, ZHAO Y H, XU B, et al. Clinical diagnostic performance of droplet digital PCR for suspected bloodstream infections[J]. Microbiol Spectr, 2023, 11(1): e0137822. doi: 10.1128/spectrum.01378-22
[18] LIU W X, WANG C, PAN F, et al. Clinical application of a multiplex droplet digital PCR in the rapid diagnosis of children with suspected bloodstream infections[J]. Pathogens, 2023, 12(5): 719. doi: 10.3390/pathogens12050719
-
期刊类型引用(1)
1. 夏冬梅，石光顺，韩婷婷，金水. 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂S在胃癌患者中的诊断价值. 实用临床医药杂志. 2025(02): 48-51 . 
本站查看
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数: 113
- HTML全文浏览量: 41
- PDF下载量: 23
- 被引次数: 1
苏公网安备 32100302010246号
