Effects of long non-coding RNA taurine up-regulated gene 1 on the proliferation, migration and angiogenesis of gastric cancer cells
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摘要:目的
探讨长链非编码RNA(lncRNA)牛磺酸上调基因1(TUG1)对胃癌细胞增殖、迁移和血管生成的影响。
方法基于公共数据库分析LncRNA TUG1在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测lncRNA TUG1在胃癌细胞系中的表达; 采用si-TUG1、si-NC转染胃癌细胞SGC-7901, 分别采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、克隆形成实验、Transwell实验和基质胶成管实验分析敲低lncRNA TUG1对胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和血管生成的影响。基于公共数据库分析烷基化修复蛋白B同源物5(ALKBH5)基因与lncRNA TUG1的相关性。采用放线菌素D实验验证ALKBH5与lncRNA TUG1的调控关系。通过细胞功能实验分析敲低ALKBH5对胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和血管生成的影响。
结果lncRNA TUG1在胃癌组织和胃癌细胞系中均表达上调; 敲低lncRNA TUG1后, SGC-7901细胞增殖、集落形成、迁移、血管生成能力均较对照细胞下降, 差异有统计学意义(P < 0.05)。数据库分析结果显示，在胃癌中, ALKBH5与lncRNA TUG1表达呈正相关(r=0.37, P < 0.05)。与对照细胞相比，敲低ALKBH5的SGC-7901细胞lncRNA TUG1的RNA稳定性下降，且细胞增殖、集落形成、迁移、血管生成能力均下降，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论ALKBH5通过诱导lncRNA TUG1表达，促进胃癌细胞的增殖、集落形成、迁移和血管生成。
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关键词:
- 胃癌 /
- 长链非编码RNA牛磺酸上调基因1 /
- 烷基化修复蛋白B同源物5 /
- 増殖 /
- 迁移 /
- 血管生成
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA (lncRNA) taurine up-regulated gene 1 (TUG1) on the proliferation, migration, and angiogenesis of gastric cancer cells.
MethodsThe expression levels of LncRNA TUG1 in gastric cancer tissues and adjacent non-cancerous tissues were analyzed based on public databases. The expression of lncRNA TUG1 in gastric cancer cell lines was detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). SGC-7901 gastric cancer cells were transfected with si-TUG1 and si-NC, and the effects of knocking down lncRNA TUG1 on cell proliferation, colony formation, migration, and angiogenesis were analyzed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay, colony formation assay, Transwell assay, and Matrigel tube formation assay. The correlation between alkB homolog 5 (ALKBH5) gene and lncRNA TUG1 was analyzed based on public databases. The regulatory relationship between ALKBH5 and lncRNA TUG1 was verified using Actinomycin D experiments. The effects of knocking down ALKBH5 on the proliferation, colony formation, migration, and angiogenesis of gastric cancer cells were analyzed through cell function experiments.
ResultsLncRNA TUG1 was up-regulated in gastric cancer tissues and cell lines. After knocking down lncRNA TUG1, the proliferation, colony formation, migration, and angiogenesis abilities of SGC-7901 cells were lower than those of control cells(P < 0.05). Database analysis results showed that ALKBH5 was positively correlated with lncRNA TUG1 expression in gastric cancer (r=0.37, P < 0.05). Compared with control cells, the RNA stability of lncRNA TUG1 in SGC-7901 cells with knocked-down ALKBH5 decreased, and the cell proliferation, colony formation, migration, and angiogenesis abilities were also reduced (P < 0.05).
ConclusionALKBH5 promotes the proliferation, colony formation, migration, and angiogenesis of gastric cancer cells by inducing the expression of lncRNA TUG1.
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胃癌的早期症状不显著，极易被忽视，多数患者确诊时病情已进展至中晚期[1], 有效评估肿瘤进展对改善胃癌患者预后具有重要意义[2]。胃镜检查和病理组织学检查是目前诊断胃癌和评估病情的主要手段，但其费用高、具有侵袭性，且需专业人员操作，临床应用受限[3]。血清肿瘤标志物检测因其无创性和高灵敏度，已逐渐被广泛用于胃癌的早期诊断和预后评估中。血清糖类抗原72-4(CA72-4)、鳞癌相关抗原(SCC)和胃泌素释放肽前体(ProGRP)均为临床常用的肿瘤标志物，对多种恶性肿瘤具有辅助诊断和预后评估价值[4]。CA72-4是一种血清糖类抗原，已被广泛用于胃癌检测。SCC常被用于鳞状细胞癌的诊断，但其在胃癌中的表达及临床意义仍有待深入探讨[5]。ProGRP广泛存在于胃肠道组织中，并在血液中稳定表达，对肿瘤进展有重要影响[6]。本研究分析血清ProGRP、SCC、CA72-4水平与胃癌淋巴结转移、组织学分级等病理参数的关系及其对患者随访期间死亡的预测价值，以期为胃癌的早期诊断和预后评估提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取滁州市第一人民医院收治的68例胃癌患者(胃癌组)、37例胃部良性病变患者(胃部良性病变组)和30例健康受试者(非胃部疾病组)作为研究对象。胃癌组和胃部良性病变组纳入标准: ①符合原发性胃癌诊断标准[7], 无其他部位恶性肿瘤，入院前未接受放放疗、化疗等胃癌系统性治疗者(胃癌组); ②经病理检查排除恶性肿瘤者(胃部良性病变组); ③年龄>18岁，首次患病者; ④自愿参与本研究并签署知情同意书者; ⑤临床资料、随访资料完整且可靠者。非胃部疾病组纳入标准: 年龄>18岁，无免疫系统疾病、血液疾病，无心、肝、肾功能障碍及恶性肿瘤者。排除标准: ①因精神异常、智力障碍等无法配合研究者; ②重要脏器功能异常者; ③哺乳期及妊娠期妇女; ④合并幽门螺杆菌感染、免疫性疾病、血液系统疾病者; ⑤合并结直肠炎、肾衰竭、肝炎等疾病者; ⑥研究开始前服用免疫抑制剂、激素类药物者。
胃癌组男42例、女26例，平均年龄(51.20± 10.35)岁，体质量指数(BMI)为(22.10±2.13) kg/m2, 胃癌分型为腺癌49例、鳞癌13例、腺鳞癌5例、印戎细胞癌1例, TNM分期为Ⅰ期10例、Ⅱ期18例、Ⅲ期26例、Ⅳ期14例; 胃部良性病变组男20例、女17例，平均年龄(48.26±8.67)岁，BMI为(21.89±2.08) kg/m2, 疾病类型为萎缩性胃炎13例、浅表性胃炎8例、胃息肉9例、胃溃疡7例; 非胃部疾病组男19例、女11例，平均年龄(49.35±9.64)岁, BMI为(22.02±2.27) kg/m2。3组研究对象性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经滁州市第一人民医院伦理委员会审核批准。
1.2 方法
1.2.1 血清学指标检测
所有研究对象入院后留取4 mL清晨空腹外周静脉血, 3 500 r/min高速离心10 min(离心半径10 cm), 留取上清。应用罗氏E601全自动电化学发光免疫分析系统，以电化学发光法检测血清ProGRP、SCC、CA72-4水平，检测过程严格遵守相关操作要求。
1.2.2 预后随访
对出院后胃癌组患者进行微信随访和电话随访，随访时间24个月，记录患者随访期间存活和死亡情况。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，计量资料以(x±s)表示, 2组比较采用独立样本t检验, 3组间比较采用单因素方差分析，采用Bonferroni校正法进行组间两两比较; 计数资料以[n(%)]表示，比较采用χ2检验; 采用多因素Logistic回归分析明确胃癌患者随访预后的影响因素，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血清ProGRP、SCC、CA72-4水平单独及联合检测对胃癌患者随访期间死亡的预测价值，计算曲线下面积(AUC)及最佳截断值, AUC比较采用Delong检验; 所有检验均为双侧检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 3组入院时血清学指标水平比较
3组间血清ProGRP、SCC、CA72-4水平比较，差异有统计学意义(F=343.459、310.041、825.479, P < 0.001); 胃癌组血清ProGRP、SCC、CA72-4水平高于胃部良性病变组、非胃部疾病组，胃部良性病变组血清ProGRP、CA72-4水平高于非胃部疾病组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 3组入院时血清学指标水平比较(x±s)组别 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) 胃癌组 68 226.35±50.68*# 3.08±0.63*# 31.08±5.46*# 胃部良性病变组 37 105.27±20.19* 1.02±0.32 4.05±0.72* 非胃部疾病组 30 20.33±3.67 0.95±0.20 3.26±0.53 ProGRP: 胃泌素释放肽前体; SCC: 鳞癌相关抗原; CA72-4: 糖类抗原72-4。与非胃部疾病组比较, * P < 0.05;
与胃部良性病变组比较, #P < 0.052.2 胃癌组血清学指标与临床病理参数的关系
胃癌组中, TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织学分级为中低分化、有淋巴结转移患者血清ProGRP、CA72-4水平分别高于Ⅰ~Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P < 0.05); 组织学分级为中低分化患者血清SCC水平高于高分化患者，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 胃癌组患者血清学指标与临床病理参数的关系分析(x±s)病理参数 分类 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) TNM分期 Ⅰ~Ⅱ期 28 210.28±40.62 2.95±0.36 25.45±4.10 Ⅲ~Ⅳ期 40 237.60±52.35* 3.17±0.64 35.02±6.02* 组织学分级 高分化 33 208.54±36.48 2.91±0.58 27.25±5.32 中低分化 35 243.14±50.79* 3.24±0.70* 34.69±4.67* 淋巴结转移 无 54 217.78±45.15 3.02±0.49 27.96±3.05 有 14 259.40±53.16* 3.31±0.63 43.11±6.08* 与同一病理参数中的另一类比较, * P < 0.05。 2.3 不同预后胃癌患者入院时血清学指标水平比较
随访24个月时，胃癌组患者存活49例(72.06%)、死亡19例(27.94%), 分别纳入存活组、死亡组。死亡组患者入院时血清ProGRP、SCC、CA72-4水平均高于存活组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 不同预后胃癌患者入院时血清学指标水平比较(x±s)组别 n ProGRP/(ng/L) SCC/(ng/mL) CA72-4/(μg/L) 存活组 49 218.60±43.25 2.82±0.47 23.50±5.39 死亡组 19 246.33±51.39* 3.18±0.65* 34.02±6.17* 与存活组比较, * P < 0.05。 2.4 胃癌患者随访预后的影响因素分析
以血清学指标水平(连续变量)为自变量，以随访预后(存活=0, 死亡=1)为因变量，进行多因素Logistic回归分析。分析结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4均为胃癌患者随访预后的独立影响因素(P < 0.05), 见表 4。
表 4 胃癌患者随访预后的多因素Logistic回归分析自变量 b SE Wald χ2 OR P 95%CI ProGRP 0.792 0.325 5.939 2.208 0.015 1.168~4.175 SCC 1.227 0.514 5.699 3.411 0.017 1.246~9.341 CA72-4 0.813 0.319 6.495 2.255 0.011 1.207~4.213 2.5 入院时血清学指标对胃癌患者随访期间死亡的预测价值
根据多因素Logistic回归分析结果建立联合预测模型: Logit(P)=-2.252+0.792(ProGRP)+ 1.227(SCC)+0.813(CA72-4), 其中P代表死亡概率。ROC曲线分析结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4水平对胃癌患者随访期间死亡均有良好的预测效能(AUC=0.766、0.705、0.828), 三者联合诊断的AUC为0.899, 大于ProGRP、SCC、CA72-4单独诊断的AUC(Z=2.455、3.492、4.932, P < 0.05), 见表 5、图 1。
表 5 入院时血清学指标对胃癌患者随访期间死亡的预测效能指标 AUC SE 最佳截断值 95%CI 灵敏度/% 特异度/% 约登指数 ProGRP 0.766 0.056 230.68 ng/L 0.656~0.876 94.70 57.10 0.518 SCC 0.705 0.064 2.94 ng/mL 0.581~0.830 75.70 65.30 0.410 CA72-4 0.828 0.052 29.235 μg/L 0.726~0.930 78.90 75.50 0.544 三者联合 0.899 0.039 — 0.824~0.975 73.60 89.80 0.634 3. 讨论
胃癌的发病率和致死率均较高，发病原因包括遗传、饮食习惯不良及接触致癌物质等[8-10]。精准预测胃癌患者的预后可为治疗策略的及时调整提供参考依据，进而保障疗效。影像学检查费用较高，在疾病早期易误诊、漏诊，且难以实现动态定量化随访。胃镜检查与组织病理学检查操作复杂，且检查过程中不适感强，部分患者存在抵触情绪。近年来，创伤小、灵敏度高的生物学指标辅助检测技术逐渐受到重视，血液肿瘤标志物水平可较好地反映肿瘤细胞增殖、浸润及迁移情况，为恶性肿瘤的临床诊疗提供依据。
糖类抗原19-9(CA19-9)、糖类抗原125(CA125)和癌胚抗原(CEA)是目前临床常用的肿瘤生物标志物，但其诊断早期胃癌的灵敏度较低，且CA19-9、CA125在胃癌、胰腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈高表达，特异度不高。CA72-4是糖链蛋白家族成员之一，在癌细胞间的信号传递中发挥重要作用，可用于恶性肿瘤的早期辅助诊断。ProGRP是消化道分泌性细胞因子胃泌素释放肽(GRP)的前体结构，可作为胃癌的特异性标志物, GRP与特异性受体结合后，可刺激部分原癌基因转录，促进疾病进展[11]。SCC作为一种肿瘤标志物，多见于肿瘤进展期，可调控肿瘤细胞的凋亡过程。本研究发现，胃癌组血清ProGRP、SCC、CA72-4水平显著高于胃部良性病变组、非胃部疾病组，胃部良性病变组血清ProGRP、CA72-4水平显著高于非胃部疾病组。吴雨林等[12]发现SCC在胃癌低分化组织中呈高表达，张磊等[13]发现胃癌患者的血清CA72-4水平高于胃部良性疾病患者及健康者，且进展期胃癌患者的CA72-4水平高于早期胃癌患者，与本研究结论一致，提示SCC、CA72-4可能与胃癌的发生发展有关。
本研究发现，血清CA72-4、SCC、ProGRP水平与胃癌TNM分期、组织学分级和淋巴结转移状态有关。TNM分期系统中, Ⅰ~Ⅱ期肿瘤的主要特征是尚未侵犯或仅局部侵犯至淋巴结和/或邻近组织，Ⅲ~Ⅳ期肿瘤则已显著侵犯淋巴结和/或邻近组织，甚至出现远处转移。本研究中, TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、组织学分级为中低分化、有淋巴结转移胃癌患者血清ProGRP、CA72-4水平分别显著高于Ⅰ~Ⅱ期、高分化、无淋巴结转移患者，提示ProGRP、CA72-4可能与肿瘤的侵袭和转移能力有关，且肿瘤细胞在分化程度较低时可能更倾向于无序生长和侵袭。本研究还发现，不同TNM分期和不同淋巴结转移状态患者的血清SCC水平无显著差异，但不同组织学分级患者的血清SCC水平存在显著差异，表明SCC可能主要与肿瘤细胞的分化程度有关。
本研究结果显示，血清ProGRP、SCC、CA72-4水平对胃癌患者随访期间死亡具有良好的预测效能，且三者联合的预测效能更佳。相较于侵入性病理组织学检查，血清生物标志物检测相对简单且无创，多个标志物联合检测可获取更全面的信息，从而更准确地预测患者的预后。相关研究[14]发现，胃癌患者血清ProGRP水平显著高于健康对照者，且与肿瘤直径、分化程度、TNM分期及淋巴结转移显著相关, ROC曲线显示ProGRP、CA72-4联合诊断胃癌的效能高。既往研究[15]指出，胃癌患者生存期与ProGRP水平显著相关, ProGRP与胃蛋白酶原联合预测胃癌患者生存时间超过中位生存期的AUC为0.898。冯苗等[16]发现, CA72-4水平高于20 μg/L是胃癌患者预后不良的危险因素。本研究中, CA72-4预测患者随访期间死亡的截断值为29.235 μg/L, 与上述研究[16]结论相符。由此提示，血清ProGRP、CA72-4、SCC或可作为胃癌患者预后的预测因子。
综上所述，胃癌患者血清ProGRP、SCC、CA72-4水平显著高于胃部良性病变患者及健康受试者，且血清ProGRP、SCC、CA72-4水平与TNM分期、组织学分级、淋巴结转移状态有关，三者联合检测对患者随访期间死亡具有很好的预测效能。
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图 1 lncRNA TUG1在胃癌中的表达及与预后的关系
A: lncRNA TUG1在胃癌组织和癌旁组织中的表达水平(两者比较, *P < 0.05); B: lncRNA TUG1在不同细胞中的表达水平(与GES-1细胞比较, **P<0.01, ***P<0.001); C: lncRNA TUG1与胃癌患者总生存期的关系; D: lncRNA TUG1与胃癌患者无病生存期的关系。
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图 2 敲低lncRNA TUG1对胃癌细胞增殖、集落形成、迁移和血管生成的影响
A: lncRNA TUG1相对表达量; B: CCK-8法实验结果; C: 克隆形成实验结果; D: Transwell实验结果; E: 基质胶成管实验结果。与si-NC组比较, *P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。
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图 3 ALKBH5在胃癌组织中的表达及与lncRNA TUG1、患者预后的关系
A: ALKBH5在不同组织中的表达(与癌旁组织比较, *P < 0.05; TPM: 转录本每百万读数); B: 胃癌中ALKBH5与lncRNA TUG1表达的相关性; C: ALKBH5与lncRNA TUG1存在结合位点; D: ALKBH5表达与胃癌患者总生存期的关系。
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图 4 SGC-7901细胞中ALKBH5与lncRNA TUG1的调控关系
A: ALKBH5相对表达量; B: lncRNA TUG1相对表达量; C: 放线菌素D实验结果。与si-NC组比较, *P < 0.05, **P<0.01。
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期刊类型引用(1)
1. 夏冬梅，石光顺，韩婷婷，金水. 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂S在胃癌患者中的诊断价值. 实用临床医药杂志. 2025(02): 48-51 . 
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