Research progress of infectious diseases in immunocompromised hosts using metagenomic next generation sequencing-based diagnostics
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摘要:
宏基因组二代测序(mNGS)通过识别临床样本中的微生物核酸来协助诊断, 是用于免疫功能低下患者感染性疾病诊断的有效工具。mNGS能够在常规检测为阴性的患者中识别出致病生物体, 但目前在免疫力低下患者中, 评估mNGS诊断感染效能的报告仅限于个体患者或小型回顾性研究。本文回顾分析文献, 为在临床中开展mNGS相关研究提供新思路。
Abstract:Metagenomic next generation sequencing (mNGS) based diagnostics that identify microbial nucleic acids in clinical samples may be a useful tool in addressing some of these challenges. Studies of mNGS in immunocompromised hosts have demonstrated that these diagnostics are capable of identifying causative organisms in a subset of patients for whom conventional testing has been negative. But the reports evaluating the diagnostic efficiency of mNGS in immunocompromised patients are limited to individual patients or small retrospective studies at present. This article reviewed and analyzed the literature to provide new ideas for conducting related research on mNGS in clinical practice.
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免疫功能低下患者可能因潜在的疾病, 如血液系统恶性肿瘤，产生类似感染的症状和体征，也可能感染罕见病原体，临床表现也不显著。感染性疾病诊断技术的进步为问题的解决提供了可能，利用非靶向的宏基因组二代测序(mNGS)来识别病原体是新的研究和开发领域，免疫功能低下患者及其感染特点，使该技术推广具有特别意义。本文回顾分析相关文献，为mNGS在临床中的应用提供新思路。
1. mNGS方法学
mNGS首先从临床样本中提取核酸，然后将提取的核酸碎片化。这些核酸片段在测序前通过PCR扩增，将扩增的序列与已知微生物序列数据库进行对比查询，计算确定核酸的源物种，来鉴定各种潜在病因——病毒、细菌、真菌和寄生虫。mNGS平台可以处理多种样本类型，其中呼吸道样本、血浆和脑脊液是最常用的测试类型。
2. mNGS用于免疫缺陷患者的病例研究
病例研究是mNGS在免疫受损群体研究中采取的主要形式之一。2008—2023年发表的部分mNGS已被应用于诊断免疫功能受损宿主感染的病例[1-7]研究，显示mNGS在常规检测无法做出诊断时用来识别感染病原体的能力。
2.1 用于诊断免疫缺陷患者中枢神经系统感染
研究显示mNGS对免疫力低下患者脑脊液或脑活检组织进行基因检测的表现, mNGS能够鉴定常规培养难以发现的罕见或新型病原体。有一篇回顾性研究[8]纳入了43例恶性肿瘤患者, mNGS在脑脊液中发现15例细菌感染, 17例病毒感染，11例真菌感染，其中4例患者死亡。有研究[9]报道了1例化疗后粒细胞缺乏的急性淋巴细胞白血病患儿德氏根霉感染致命的病例, mNGS在血液和脑脊液中均发现了德氏根霉。另有研究[10]报道了1例非霍奇金淋巴瘤病史的患者，初始多个脑脊液样本的检测结果仅显示α干扰素升高未发现病原体, mNGS在其脑组织中发现了克里斯托利病毒。此外病例报告[11]报道了1例接受利妥昔单抗治疗后的滤泡性淋巴瘤患者，该患者最初表现为发热和睾丸附睾炎，常规血液、脑脊液检测未发现病原体, mNGS在其脑脊液中发现了波瓦桑病毒，死后进行脑组织活检波瓦桑病毒抗原均为阳性。还有一篇病例报告[12]报道免疫力低下的患者，脑脊液mNGS提示戊型肝炎病毒和肺炎克雷伯菌，但脑脊液培养阴性，提示戊型肝炎病毒可以通过血脑屏障导致中枢神经系统感染。
对于上述报告中提到的致病病原体，目前临床诊断通常依赖于血清学检测，常规检验方法在免疫功能低下患者中可信度不高。在波瓦桑病毒[11]病例中，初始抗体检测为阴性，说明血清学检测在该人群中的实用性有限。在血清学检测阳性不能诊断活动性感染的情况下, mNGS可被用于区分既往感染和活动性感染，例如有报道[13]用于鉴别人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性患者因弓形虫引起的中枢神经系统感染。
2.2 用于诊断免疫缺陷患者血源性感染
个案研究主要针对免疫功能低下患者感染性疾病诊断困难的宿主，进行血浆mNGS检测来协助诊断。在某些病例中，即使在血流或播散性感染的情况下，血培养也不一定发现病原体或者容易出现误导性结果。RAMCHANDAR N等[14]报道了1例接受过造血干细胞移植(HSCT)的急性髓系白血病、脓毒症患者，其血培养结果是溶血性葡萄球菌，而血浆mNGS却显示该患者是播散性弓形虫病。
血浆mNGS也被证明在涉及多种微生物感染时，能够识别单个物种。相关研究[15]明确了1例62岁男性的感染病因，该男性因急性白血病接受了造血干细胞移植并接受了免疫抑制治疗。他的肺部情况逐渐恶化，随后出现局灶性神经系统病变和皮肤病变，其支气管肺泡灌洗液(BALF)中半乳甘露聚糖试验呈阳性，且培养物鉴定出一种名为烟曲霉的霉菌。皮肤病变病理活检却提示毛霉菌。血浆mNGS又显示患者血液中小克银汉霉属(一种毛霉菌目)DNA水平升高，以及比烟曲霉菌更耐药的肠曲霉DNA水平升高，证实患者有两种不同病原体混合感染的过程，使用曲霉病的常规抗真菌治疗可能没有效果。然而mNGS也不是万能的, 1例79岁的慢性淋巴细胞白血病男性患者影像学提示伴有脑和肺部病变，血培养、半乳甘露聚糖试验、(1，3)-β-D-葡聚糖等常规检查均阴性，其血浆mNGS显示出诺卡菌感染的强烈信号，但患者死亡后尸检分析却发现肺组织中还存在烟曲霉菌、心脏和肾脏存在毛霉菌、脑组织中存在诺卡菌[16]。
3. mNGS用于免疫缺陷患者的前瞻性和回顾性研究
病例研究主要讲述了mNGS作为免疫缺陷患者感染性疾病诊断工具的个案情况。而队列研究可以对mNGS的表现提供更全面的观点。
3.1 脑脊液(CSF)
一项大型前瞻性研究[17]将204例患者纳入研究，使用mNGS诊断住院患者的脊髓炎、脑膜炎和脑炎(PDAID研究)，以及2项小规模回顾性研究，分别纳入41例[18]和80例[7]脑炎患者。每项研究中免疫功能低下患者队列比例分别为40.7%、100%和32%。这些研究主要评估了2种类型的指标。首先是mNGS检测性能的评估，如敏感性或阳性一致性百分比，特异性或阴性一致性百分比。这3项研究的显著特征是脑脊液mNGS检测呈阳性的病例比例较低，分别为16%、15%和12%。CARBO E C等[18]回顾性研究中，脑脊液mNGS能够在所有18个病例中识别致病生物体，这表明该测试在免疫受损人群中具有高敏感性。而PDAID研究中估算的CSF mNGS阳性一致性百分比为80%, 阴性一致性估计为98.2%, 阴性预测值为95%, 阳性预测值为91%, 但在RODINO K G等[7]研究中阳性预测值仅为42%。
除了对CSF mNGS性能进行评估外，这些研究另一个终点是mNGS对临床的影响。PDAID研究估计，在13例mNGS单独鉴定病原体的病例中，有8例mNGS检测结果具有临床影响。而RODINO K G等研究中，5例“真阳性”mNGS结果中有3例产生临床影响，另外2例缺乏临床影响数据。排除感染是临床医生进行CSF mNGS检测的常见原因，与常规检测一致的mNGS结果可能在临床上有助于确认诊断或帮助排除重叠感染。然而，上述研究作者未在其研究中提供mNGS实际改变临床管理的概率。
3.2 血浆
在免疫功能低下群体中，有更多mNGS血浆样本的数据。ROSSOFF J等[1]指出，血浆mNGS在免疫受损患者中具有更高的地位，在该研究中免疫受损患者中61%的检测呈阳性，而在免疫正常患者中为35%。LEE R A等[3]回顾性分析患者各种临床特征来评估血浆mNGS在临床中的效用，发现免疫功能低下状态更接近显著性。这些研究中，血浆mNGS结果产生临床影响的8个病例中有7个是免疫功能受损患者，而mNGS做出新诊断的5个病例也都是免疫功能受损患者。
巨细胞病毒(CMV)原发性感染或再激活是免疫功能低下患者发病和死亡的重要原因，但盲目抗病毒会使耐药性增加[19]，该研究纳入43个血浆样本, mNGS在该研究中被验证能准确检测CMV与抗病毒耐药性相关的 UL54 和 UL97 基因突变，可以准确地预测常见抗病毒药物(包括更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠)的耐药性，有助于及时管理CMV感染且具有抗病毒耐药临床指征的患者。
3.3 呼吸道样本
呼吸道样本与血浆、脑脊液样本的区别在于呼吸道样本很少是无菌的。这有可能增加呼吸道样本mNGS“假阳性”结果数量。同时，呼吸道样本mNGS研究相互比较，由于使用不同的样本类型，口咽拭子、气管抽吸液、支气管肺泡灌洗液(BALF)、微小支气管肺泡灌洗液(mini-BALF)、支气管刷诊和经支气管活检或混合样本，结果也会更为复杂。研究[20-22]显示, mNGS性能的主要衡量标准是比较呼吸道标本和血液样本的敏感性和一致性，尽管研究之间存在差异，但报告显示mNGS优于传统病原学检测。有研究[22]评估需要机械通气的儿童上呼吸道样本与下呼吸道样本之间的一致性和差异性, 295名受试者同时进行mNGS和常规方法检测，仅统计下呼吸道样本病例鉴定的病原体阳性一致性从87.7%到96%不等，而与鼻咽等上呼吸道样本一起统计时阳性一致性只有41.3%。有研究[23-24]评估了mNGS检测与常规呼吸道标本检测同时进行的临床影响。WU X D等[24]显示，纳入的79%病例中，mNGS检测结果影响抗菌素使用的升级或降级。
3.4 尿标本
有研究[25-26]报道了尿液样本mNGS可用于临床监测肾移植患者，尿液mNGS对BK病毒具有高度敏感，早期干预治疗可以改善移植肾的存活率，并且mNGS对细菌性尿路感染病原体亦具有高度敏感性。
4. 临床意义及不足之处
mNGS常被认为是常规检验的替代品，但目前mNGS多在临床中作为标准微生物检测的补充，因此mNGS需要提供其他检测无法呈现的有价值的信息。对于很多难以诊断的病例，mNGS常在其他常规微生物检测未发现病原体时或已使用广谱抗菌药物治疗后才进行，并且mNGS识别出前几轮常规检验未发现的生物体时，才判断其具有临床效果。此外研究[27-28]提示，不同样本类型对mNGS的准确性有很大影响，合适的样本可以提高mNGS准确性和阳性率。另有研究[29]显示，病原体的临床诊断周期延长会导致广谱抗生素使用周期延长，将导致患者抗生素耐药性进一步升高。研究人员选择的队列研究中，通常同时进行了mNGS与常规检验，并且mNGS可能比其他常规微生物测试更早获得结果。目前为止, mNGS评估临床终点需要通过临床医生报告，这种评估会存在主观偏见。另一个问题是，现在mNGS临床影响评估都是观察性的，对照研究较少。因此，虽然一些临床医生已经使用mNGS作为感染性疾病的补充诊断方法，但目前关于mNGS临床影响的数据有限。
另一个影响mNGS临床应用的重要因素是报告周期。尽管mNGS检测周转时间长曾被认为是潜在缺陷[30-31], 既往研究[32]报告显示mNGS平均周转时间为4~5 d, 但近年来大多数报告周期缩短为1~2 d[33]。这些研究中，样本既送检了外部实验室的商业测试，也送检了医疗机构内部实验室进行测试。这说明报告周期不会成为临床使用mNGS的主要障碍，特别随着mNGS在临床中的广泛使用和平台的进一步优化，报告周期会进一步缩短。
5. 小结
免疫功能低下患者是mNGS诊断应用中的一个重要群体。mNGS检测的敏感性和特异性可能因微生物病原学特点和感染部位而有差异。检测之前应考虑mNGS结果影响患者治疗的可能性。总之, mNGS结果对临床诊疗，尤其是免疫功能低下这类群体的前瞻性研究效用较大，其发展和应用前景与检测人员能否将复杂的原始数据优化转换为临床医生可以便捷使用的可靠信息密切相关。
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[1] ROSSOFF J, CHAUDHURY S, SONEJI M, et al. Noninvasive diagnosis of infection using plasma next-generation sequencing: a single-center experience[J]. Open Forum Infect Dis, 2019, 6(8): ofz327. doi: 10.1093/ofid/ofz327
[2] HOGAN C A, YANG S X, GARNER O B, et al. Clinical impact of metagenomic next-generation sequencing of plasma cell-free DNA for the diagnosis of infectious diseases: a multicenter retrospective cohort study[J]. Clin Infect Dis, 2021, 72(2): 239-245. doi: 10.1093/cid/ciaa035
[3] LEE R A, DHAHERI F A, POLLOCK N R, et al. Assessment of the clinical utility of plasma metagenomic next-generation sequencing in a pediatric hospital population[J]. J Clin Microbiol, 2020, 58(7): e00419-e00420.
[4] NILES D T, WIJETUNGE D S S, PALAZZI D L, et al. Plasma metagenomic next-generation sequencing assay for identifying pathogens: a retrospective review of test utilization in a large children's hospital[J]. J Clin Microbiol, 2020, 58(11): e00794-e00720.
[5] YU J, DIAZ J D, GOLDSTEIN S C, et al. Impact of next-generation sequencing cell-free pathogen DNA test on antimicrobial management in adults with hematological malignancies and transplant recipients with suspected infections[J]. Transplant Cell Ther, 2021, 27(6): 500. e1-500. e6. doi: 10.1016/j.jtct.2021.02.025
[6] KUFNER V, PLATE A, SCHMUTZ S, et al. Two years of viral metagenomics in a tertiary diagnostics unit: evaluation of the first 105 cases[J]. Genes, 2019, 10(9): 661. doi: 10.3390/genes10090661
[7] RODINO K G, TOLEDANO M, NORGAN A P, et al. Retrospective review of clinical utility of shotgun metagenomic sequencing testing of cerebrospinal fluid from a U. S. tertiary care medical center[J]. J Clin Microbiol, 2020, 58(12): e01729-e01720.
[8] 刘雅婷, 宋飞雪, 李鑫, 等. 宏基因组二代测序在恶性肿瘤患者伴发颅内感染的临床应用及分析[J]. 兰州大学学报: 医学版, 2021, 47(5): 49-54. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-LZYX202105008.htm [9] 李文梓, 朱华, 全美洁, 等. 宏基因组二代测序在儿童急性白血病化疗后合并毛霉菌病早期诊断中的应用价值[J]. 中国小儿血液与肿瘤杂志, 2022, 8(6): 363-366. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGXY202206003.htm [10] RODRIGUEZ C, GRICOURT G, NDEBI M, et al. Fatal encephalitis caused by cristoli virus, an emerging orthobunyavirus, France[J]. Emerg Infect Dis, 2020, 26(6): 1287-1290. doi: 10.3201/eid2606.191431
[11] SOLOMON I H, SPERA K M, RYAN S L, et al. Fatal powassan encephalitis (Deer tick virus, lineage Ⅱ) in a patient with fever and orchitis receiving rituximab[J]. JAMA Neurol, 2018, 75(6): 746-750. doi: 10.1001/jamaneurol.2018.0132
[12] CUI M M, SUN W, XUE Y, et al. Hepatitis E virus and Klebsiella pneumoniae co-infection detected by metagenomics next-generation sequencing in a patient with central nervous system and bloodstream Infection: a case report[J]. BMC Infect Dis, 2024, 24(1): 33. doi: 10.1186/s12879-023-08850-4
[13] HU Z L, WENG X, XU C H, et al. Metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for toxoplasmic encephalitis[J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2018, 17(1): 45. doi: 10.1186/s12941-018-0298-1
[14] RAMCHANDAR N, PONG A, ANDERSON E. Identification of disseminated toxoplasmosis by plasma next-generation sequencing in a teenager with rapidly progressive multiorgan failure following haploidentical stem cell transplantation[J]. Pediatr Blood Cancer, 2020, 67(4): e28205. doi: 10.1002/pbc.28205
[15] STEINBRINK J M, HONG D K, BERGIN S P, et al. The robust and rapid role of molecular testing in precision fungal diagnostics: a case report[J]. Med Mycol Case Rep, 2020, 27: 77-80. doi: 10.1016/j.mmcr.2020.02.003
[16] TSIKALA-VAFEA M, CAO W B, OLSZEWSKI A J, et al. Fatal mucormycosis and aspergillosis in an atypical host: what do we know about mixed invasive mold infections?[J]. Case Rep Infect Dis, 2020, 2020: 8812528.
[17] WILSON M R, SAMPLE H A, ZORN K C, et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis[J]. N Engl J Med, 2019, 380(24): 2327-2340. doi: 10.1056/NEJMoa1803396
[18] CARBO E C, BUDDINGH E P, KARELIOTI E, et al. Improved diagnosis of viral encephalitis in adult and pediatric hematological patients using viral metagenomics[J]. J Clin Virol, 2020, 130: 104566. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104566
[19] STRECK N T, ESPY M J, FERBER M J, et al. Use of next-generation sequencing to detect mutations associated with antiviral drug resistance in cytomegalovirus[J]. J Clin Microbiol, 2023, 61(10): e0042923. doi: 10.1128/jcm.00429-23
[20] TEKIN A, TRUONG H H, ROVATI L, et al. The diagnostic accuracy of metagenomic next-generation sequencing in diagnosing Pneumocystis pneumonia: a systemic review and meta-analysis[J]. Open Forum Infect Dis, 2023, 10(9): ofad442. doi: 10.1093/ofid/ofad442
[21] DAVID J A, KOLIPAKKAM B, MORALES M K, et al. Cell-free plasma next-generation sequencing assists in the evaluation of secondary pneumonia in patients with COVID-19: a case series[J]. Epidemiol Infect, 2023, 151: e185. doi: 10.1017/S0950268823001711
[22] OSBORNE C M, LANGELIER C, KAMM J, et al. Viral detection by reverse transcriptase polymerase chain reaction in upper respiratory tract and metagenomic RNA sequencing in lower respiratory tract in critically ill children with suspected lower respiratory tract infection[J]. Pediatr Crit Care Med, 2024, 25(1): e1-e11. doi: 10.1097/PCC.0000000000003336
[23] LANGELIER C, KALANTAR K L, MOAZED F, et al. Integrating host response and unbiased microbe detection for lower respiratory tract infection diagnosis in critically ill adults[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(52): E12353-E12362.
[24] WU X D, LI Y Y, ZHANG M, et al. Etiology of severe community-acquired pneumonia in adults based on metagenomic next-generation sequencing: a prospective multicenter study[J]. Infect Dis Ther, 2020, 9(4): 1003-1015. doi: 10.1007/s40121-020-00353-y
[25] BURNHAM P, DADHANIA D, HEYANG M, et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract[J]. Nat Commun, 2018, 9(1): 2412. doi: 10.1038/s41467-018-04745-0
[26] CHENG A P, BURNHAM P, LEE J R, et al. A cell-free DNA metagenomic sequencing assay that integrates the host injury response to infection[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2019, 116(37): 18738-18744. doi: 10.1073/pnas.1906320116
[27] XIAO G H, CAI Z, GUO Q L, et al. Insights into the unique lung microbiota profile of pulmonary tuberculosis patients using metagenomic next-generation sequencing[J]. Microbiol Spectr, 2022, 10(1): e0190121. doi: 10.1128/spectrum.01901-21
[28] FOURGEAUD J, REGNAULT B, OK V, et al. Performance of clinical metagenomics in France: a prospective observational study[J]. Lancet Microbe, 2024, 5(1): e52-e61. doi: 10.1016/S2666-5247(23)00244-6
[29] 曹泽锟, 苏奕晨, 谷俊远, 等. 基于CiteSpace和VOSviewer的抗菌药物治疗腹腔感染研究热点的可视化分析[J]. 实用临床医药杂志, 2023, 27(20): 74-79, 85. doi: 10.7619/jcmp.20231240 [30] SHEN H P, SHEN D Y, SONG H, et al. Clinical assessment of the utility of metagenomic next-generation sequencing in pediatric patients of hematology department[J]. Int J Lab Hematol, 2021, 43(2): 244-249. doi: 10.1111/ijlh.13370
[31] GOGGIN K P, GONZALEZ-PENA V, INABA Y, et al. Evaluation of plasma microbial cell-free DNA sequencing to predict bloodstream infection in pediatric patients with relapsed or refractory cancer[J]. JAMA Oncol, 2020, 6(4): 552-556. doi: 10.1001/jamaoncol.2019.4120
[32] BENAMU E, GAJUREL K, ANDERSON J N, et al. Plasma microbial cell-free DNA next-generation sequencing in the diagnosis and management of febrile neutropenia[J]. Clin Infect Dis, 2022, 74(9): 1659-1668. doi: 10.1093/cid/ciab324
[33] WANG Q, SONG Y G, HAN D M, et al. The first suspected disseminated Hormographiella aspergillata infection in China, diagnosed using metagenomic next-generation sequencing: a case report and literature review[J]. Emerg Microbes Infect, 2023, 12(1): 2220581. doi: 10.1080/22221751.2023.2220581
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