Experimental study in prevention of epidural fibrosis in rats by local application of hydroxyurea
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摘要:目的
探讨大鼠椎板切除术后预防性局部使用羟基脲(HU)的疗效。
方法选取8周龄SD大鼠36只，随机分为A组(对照)、B组(15 mg/mL HU)、C组(30 mg/mL HU)。制备椎板切除术模型; 暴露硬脊膜后, A组生理盐水冲洗后逐层关闭术区，B、C组分别以浸湿不同浓度的HU棉垫放入术区内5 min后移除，逐层闭合术区。观察手术前后大鼠脊髓评分的变化。术后4周，通过一般观察、苏木精-伊红(HE)染色、成纤维细胞计数、天狼猩红染色和免疫组织化学染色来评估术后硬膜外粘连情况。
结果各组手术前后的大鼠脊髓评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)。大体观察和HE染色显示，与A组相比, B、C组大鼠术区硬膜外粘连程度明显减轻。采用Image J对各组成纤维细胞计数，与A组相比，B、C组成纤维细胞数量呈浓度依赖性下降，差异有统计学意义(P < 0.001或P < 0.000 1); 与B组比较, C组成纤维细胞数量更低，差异有统计学意义(P < 0.01)。天狼猩红染色显示B、C组中Ⅰ型胶原纤维显著减少, Ⅲ型胶原纤维表达增多。
结论大鼠椎板切除术后局部应用HU可以减缓硬膜外纤维化的发生。
Abstract:ObjectiveTo explore the efficacy of postoperative topical preventive application of hydroxyurea (HU) in the rats with laminectomy.
MethodsA total of 36 8-week SD rats were selected and randomly divided into group A (controls), group B (15 mg/mL HU) and group C (30 mg/mL HU). A laminectomy model was prepared; after exposing the dura mater, the surgical area was closed layer by layer after flushing with physiological saline in the group A, while in the group B and the group C, different concentrations of HU cotton pads were soaked and placed in the surgical area for 5 minutes before removal, and the surgical area was closed layer by layer. Change in spinal cord scores of rats before and after surgery was observed. At 4 weeks after surgery, the postoperative epidural adhesions were evaluated through macroscopic observation, hematoxylin eosin (HE) staining, fibroblast counting, Sirius red staining and immunohistochemical staining.
ResultsThere was no significant difference in the spinal cord scores of rats before and after surgery among the three groups (P>0.05). Macroscopic observation and HE staining showed that compared with the group A, the degrees of epidural adhesion in the surgical area of rats in the group B and the group C were significantly reduced. Image J was used to count fiber cells in each group, and compared with the group A, the number of fibroblasts in the group B and the group C decreased significantly in a concentration dependent manner (P < 0.001 or P < 0.000 1); compared with the group B, the number of fibroblasts in the group C was significantly lower (P < 0.01). Sirius red staining showed a significant decrease in type Ⅰ collagen fibers expression and a significant increase in type Ⅲ collagen fiber expression in the group B and the group C.
ConclusionPostoperative topical application of HU in the rats with laminectomy can slow down the occurrence of epidural fibrosis.
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Keywords:
- hydroxyurea /
- epidural fibrosis /
- laminectomy /
- prevention /
- topical application /
- rats
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腰椎手术失败综合征(FBSS)是指腰椎间盘切除术、椎间盘摘除术或神经根减压术后出现的体征和症状，如腰部、臀部或下肢持续性疼痛以及功能减退等[1-3]。每年约有24%的FBSS由硬膜外纤维化引起，发病率较高，在术区形成瘢痕或组织纤维化，包绕和(或)附着于硬膜外和(或)外侧神经根，导致脊柱手术后功能丧失和疼痛[4-6]。成纤维细胞有丝分裂增殖并从周围组织迁移是硬膜外纤维化发生的重要原因。为了在瘢痕形成以外的再生条件下控制手术损伤修复，各种药物和材料在内的方法已被证明可减轻硬膜外纤维化[1, 7-8]。
羟基脲(HU)是许多动物种属中天然存在的细胞增殖抑制剂，其组织浓度可高达250 μmol/L, 是核糖核苷酸还原酶(RNR)的抑制剂。RNR是参与脱氧核糖核苷酸合成的关键酶，已成为治疗多种疾病的有效药物，如用于脑肿瘤、骨髓增殖性疾病和镰状细胞贫血的联合治疗，并在阿尔茨海默病(AD)小鼠模型中显示出改善空间记忆的作用，这使其成为延缓AD认知功能下降的有前途的治疗方法[9-11]。尽管RNR对DNA合成和细胞增殖的影响是普遍的，但一定浓度下HU治疗被认为是安全的，不良反应较少。本研究探讨HU在体内对大鼠椎板切除术后硬膜外纤维化形成的影响，以评估其抗硬膜外纤维化潜力，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 实验试剂
HU(货号IH0150)、HE染色试剂盒(货号G1120)、天狼猩红(S8060)、4%多聚甲醛溶液、柠檬酸钠抗原修复液购自Solarbio公司; EDTA脱钙液(货号DD000201)购自leagene生物; 免疫组化染色试剂盒(货号KGOS60)购自凯基生物。
1.2 动物造模及分组
从扬州大学比较医学中心选取36只雄性SD大鼠，鼠龄8周，体质量260~320 g。所有大鼠均在扬州大学比较医学中心饲养，常温下、常湿度下正常摄食和饮水。本实验经扬州大学动物伦理委员会批准，动物合格证号为SCXK(苏)2017-0007。参考既往研究[10, 12]方法，随机将大鼠分为A组(对照组)、B组(15 mg/mL HU组)、C组(30 mg/mL HU组)。腹腔内麻醉使用1%戊巴比妥钠，剂量为40 mg/kg; 俯卧位固定背侧区域，进行备皮和标记，然后进行常规消毒和铺巾，在L1~L2水平逐层分离组织，完全暴露L1椎体，然后切除L1椎板并暴露硬膜囊; 采用生理盐水清洗该区域后，在无活动性出血的情况下，将浸润生理盐水的棉垫置于A组骨缺损区域5 min，然后取出棉垫，逐层缝合该区域; B、C组则分别将浸润不同浓度的HU棉垫置入骨缺损区5 min后取出，逐层缝合术区。手术全程动作轻柔，遵循无菌原则，防止硬脊膜受损。术后常规应用抗生素防止感染发生。
1.3 观察指标
1.3.1 安全性评估
术后每周采用大鼠脊髓损伤评分体系评估大鼠行为功能情况[13]: 0分为无可见后肢运动; 1分为1个或2个关节轻微运动，通常为髋和(或)膝关节; 2分为1个关节大幅活动或1个关节大幅活动且有另1个关节轻微活动; 3分为2个关节大幅活动; 4分为后肢全部3个关节可轻微活动; 5分为后2个关节轻微活动，第3个关节可大幅活动; 6分为2个关节大幅活动，第3个关节可轻微活动; 7分为后肢全部3个关节可大幅活动; 8分为非承重情况下可以爪掌面着地; 9分为足底仅位于负重位，或偶尔/频繁/持续以足背负重步行，无足底负重步行; 10分为偶见爪掌面承重移动，但无前后肢协调动作; 11分为可较多地见到掌面承重移动，但未见后肢协调动作; 12分为可较多地见到掌面承重移动，偶见前后肢协调动作; 13分为常见掌面承重移动，可常见前后肢协调动作; 14分为有持续性掌面承重移动和前后肢协调动作，或出现常见的掌面移动，持续性前后肢协调动作，偶有爪背侧移动; 15分为持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中无或偶有抓地，初接触时主动爪位置与身体平行; 16分为步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地，初接触时主动爪位置与身体平行，负重转移后旋转; 17分为步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中常见爪抓地，初接触时和负重旋转后主动爪位置均与身体平行; 18分为步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地，初接触时主动爪位置均与身体平行，负重转移后旋转; 19分为步态中可见持续性掌面移动和持续性前后肢协调动作，前肢前进过程中可持续性爪抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，尾巴有时或总是下垂; 20分为持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，初接触时和负重转移后主动爪位置均与身体平行，躯干不稳定，尾巴持续翘起; 21分为持续性掌面移动，持续性协调步态，足趾持续抓地，活动过程中主动爪位置始终与身体平行，躯干持续稳定，尾巴持续翘起。
1.3.2 大体观察
术后4周，每组随机抽取6只大鼠。麻醉后，按照前述的方法进行局部解剖。手术部位硬膜外瘢痕粘连根据改良Rydell标准进行评估[14]: 0级为手术区无明显粘连，硬膜囊区无增生性瘢痕组织; 1级为术区硬膜囊外可见散在增生瘢痕组织粘连，硬膜囊和增生的瘢痕组织易于分离; 2级为手术区可见周围瘢痕组织，致密的硬膜囊融合难以分离; 3级为手术区硬膜外粘连广泛且致密，从解剖学角度无法将瘢痕组织与原硬膜囊分离。
1.3.3 组织学观察
① HE染色。术后4周，将各组剩余大鼠采用过量麻醉方法处死。通过离断上下脊柱节段获取离体组织，血液用生理盐水冲洗后转移至4%多聚甲醛中固定，脱钙脱水后制备石蜡标本并切片，在60 ℃下烘烤1 h, 然后依次通过二甲苯、梯度乙醇、苏木素、盐酸乙醇、伊红，再通过梯度乙醇、二甲苯，最后中性树胶封固，显微镜下观察。HE染色可显示成纤维细胞核呈蓝色，可反映各组术后硬膜外粘连的情况。②免疫组织化学染色。石蜡切片在60 ℃的烘箱中烘烤1 h，然后依次通过二甲苯、梯度乙醇、高压抗原修复、封闭、一抗孵化过夜、二抗孵育、DAB显色、复染，然后通过梯度乙醇脱水和二甲苯透明后中性树脂封固，在光学显微镜下观察各组切片染色情况。③天狼猩红染色。石蜡切片烤片1 h后，依次通过二甲苯、梯度乙醇脱蜡脱水，铁苏木素、天狼猩红染色，再通过梯度乙醇和二甲苯脱水透明后中性树脂封固，偏振光显微镜下观察染色情况。
1.4 统计学分析
采用SPSS 25.0软件分析实验数据，每组数据重复3次，计量数据以均值±标准差表示, 3组间比较采用方差分析，组间比较采用单样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 安全性评估
整个实验过程中未出现伤口感染、死亡等不良事件。根据大鼠脊髓损伤评分综合评估各组手术前后的运动幅度、肢体关节活动、步态、躯干运动等，结果显示各组BBB评分得分一致(21分)。
2.2 各组大鼠硬膜外粘连程度比较
大体观察发现, A组术区周围出现广泛的硬膜外粘连，组织结果致密，不易与硬膜解剖分离且分离过程中伴有硬膜囊损伤, Rydell分级3级。与A组相比, B组术区有不同程度的硬膜外瘢痕粘连，但很容易剥离，硬膜囊保持完整, Rydell分级2级。C组手术区域可观察到少量松散的瘢痕粘连，很容易与周围的硬膜囊分离, Rydell分级Ⅰ级。
2.3 各组大鼠成纤维数量比较
A组硬膜外瘢痕组织结构致密(箭头)，与周围硬膜广泛粘连，瘢痕区域有大量成纤维细胞。B组可见硬膜外粘连程度减轻(箭头)，瘢痕区域成纤维细胞数量与前者相比明显减少。C组可见硬膜外粘连稀疏，可见空隙存在(箭头)，瘢痕区域成纤维细胞数量较少。采用Image J对各组成纤维细胞计数，与A组相比，B、C组成纤维细胞数量呈浓度依赖性下降，差异有统计学意义(P < 0.001或P < 0.000 1); 与B组比较，C组成纤维细胞数量更低，差异有统计学意义(P < 0.01)。见表 1和图 1A、1B。
表 1 各组切片中成纤维细胞计数比较(n=3)(x±s)组别 成纤维细胞计数 A组(对照) 106.47±8.62 B组(15 mg/mL HU) 69.00±4.58*** C组(30 mg/mL HU) 37.33±4.16****## 与A组比较, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1;与B组比较, ##P < 0.01。 ![]()
图 1 各组大鼠组织学分析A: 各组硬膜外瘢痕粘连程度的HE染色结果; B: 各组成纤维细胞数量比较; C: 免疫组织化学染色可见
HU干预后PCNA表达降低，天狼猩红染色可见HU组随着浓度增高，Ⅲ型胶原纤维的表达增多; D: 各组PCNA阳性细胞表达比率比较。A组为对照, B组为15 mg/mL HU, C组为30 mg/mL HU。与A组比较, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1; 与B组比较, **P < 0.01。2.4 各组大鼠细胞增殖比较
增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞DNA合成密切相关，在细胞增殖的启动过程中发挥着重要作用，是反映细胞增殖的良好指标。免疫组织化学染色结果显示，与A组比较, B、C组可见PCNA蛋白表达降低且呈剂量依赖性减少，差异有统计学意义(P < 0.001或P < 0.000 1); 与B组比较，C组PCNA表达更低，差异有统计学意义(P < 0.01)。在偏振光显微镜下, A组中可见Ⅰ型胶原纤维排列紧密，折光性强，呈现明显的橙红色; Ⅲ型胶原纤维数量少且稀有，呈现绿色。C组中可见Ⅲ型胶原纤维数量增多, Ⅰ型胶原纤维数量显著减少。B组则介于A组与B组之间。见图 1C、1D。
3. 讨论
FBSS难以通过药物和物理治疗等非手术方法得到根治[3]。FBSS可能是永久性的，腰椎术后FBSS发生率高达20%~40%。硬膜外纤维化又称椎板切除术后综合征，被公认为是椎板切除术后患者狭窄或椎间盘突出等原因导致FBSS的重要原因。由于硬膜囊牵拉，其可能引起类神经根性症状，大大降低手术成功率[15-17]。脊柱术后创面修复是一个复杂的炎症过程，在早期阶段，中性粒细胞和巨噬细胞浸润到伤口区域，在晚期阶段炎症消退，纤维化级联反应启动，导致硬膜外纤维化。硬膜外纤维化和硬膜外粘连的过程涉及成纤维细胞的增殖分化和细胞外基质(ECM)蛋白的过度沉积[18-21]。持续的成纤维细胞增殖、活化和迁移通常被认为是伤口的愈合反应，在组织损伤后持续发生。硬膜外纤维化的发生可能会给手术后脊髓和神经造成极大的负担[22-24]。
HU对DNA合成和细胞增殖的影响是普遍的。1967年, HU首次被美国FDA批准上市，作为抗肿瘤药物具有较好的疗效[9], 随后其适用范围不断扩大，逐渐用于慢性粒细胞白血病、银屑病、黑色素瘤、卵巢癌、真性红细胞增多症、镰状细胞贫血，甚至是艾滋病病毒[11, 25-27]。HU的主要作用机制是可逆性地抑制核糖核苷酸还原酶(RR), 这是一种将核糖核苷转化为脱氧核糖核苷的关键酶，对于DNA的功能是必需的[28]。RR被抑制后，将导致细胞内脱氧核糖核苷酸三磷酸的下降，并通过S期阻碍细胞分裂的进展。研究[27, 29]发现，HU以其独特的药理作用可能对人类的纤维化具有额外的保护作用，因为其可以改善纤维化相关的缺氧，从而防止纤维化的发生，而缺氧也被认为是促进纤维化的重要因素。然而, HU作为一种抗肿瘤药物，其长期应用的风险和益处仍存在一些问题，主要集中在应用剂量方面[12]。最近的研究[30]显示, HU是预防阿尔茨海默病认知功能下降的有前途的药物。此外, HU还可以提高胎儿血红蛋白水平，从而改变血红蛋白S聚合的动力学，并被证明可以减少血细胞与血管内皮细胞的黏附，可以使镰状细胞性贫血的患儿受益[31-33]。
本研究结果显示，局部应用HU可抑制大鼠椎板切除术后成纤维细胞增殖，减少术区ECM沉积，抑制大鼠椎板切除术后硬膜外纤维化，推断局部应用HU可以预防大鼠椎板术后硬膜外纤维化。
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图 1 各组大鼠组织学分析
A: 各组硬膜外瘢痕粘连程度的HE染色结果; B: 各组成纤维细胞数量比较; C: 免疫组织化学染色可见
HU干预后PCNA表达降低，天狼猩红染色可见HU组随着浓度增高，Ⅲ型胶原纤维的表达增多; D: 各组PCNA阳性细胞表达比率比较。A组为对照, B组为15 mg/mL HU, C组为30 mg/mL HU。与A组比较, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1; 与B组比较, **P < 0.01。表 1 各组切片中成纤维细胞计数比较(n=3)(x±s)
组别 成纤维细胞计数 A组(对照) 106.47±8.62 B组(15 mg/mL HU) 69.00±4.58*** C组(30 mg/mL HU) 37.33±4.16****## 与A组比较, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1;与B组比较, ##P < 0.01。 
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