Effect and mechanism of salidroside for 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine induced Parkinson's disease in mice
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摘要:目的
探讨红景天苷对1-甲基-4-苯基-1-2-3-6-四氢吡啶（MPTP）诱导帕金森病（PD）小鼠的作用及机制。
方法通过MPTP诱导C57BL/6J小鼠建立PD小鼠模型，通过旷场实验记录小鼠行动轨迹；采用免疫组织化学法检测小鼠脑组织酪氨酸羟化酶（TH）、α-突触核蛋白（α-syn）、核因子E2相关因子2（Nrf2）和醌氧化还原酶1（NQO1）表达变化。通过MPTP刺激SN4741细胞建立PD体外细胞模型，红景天苷预处理后，采用TUNEL实验检测各组细胞凋亡情况；采用免疫荧光法检测各组细胞TH、α-syn、Nrf2和NQO1表达变化情况；转染si-RNA敲减Nrf2表达，采用TUNEL实验检测各组细胞凋亡情况。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脑组织提取液和细胞培养液中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）蛋白表达水平。
结果旷场实验结果显示，红景天苷能够改善PD小鼠3 min活动总距离、平均速度和活动轨迹，差异有统计学意义（P < 0.05）；与PD模型小鼠相比，红景天苷处理的PD小鼠大脑TH、Nrf2、NQO1表达增加，α-syn、IL-1β、IL-18表达减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；与MPTP刺激细胞相比，红景天苷预处理组细胞凋亡减少，TH、Nrf2和NQO1表达增高，α-syn、IL-1β和IL-18表达降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；敲减Nrf2表达后，红景天苷对MPTP刺激细胞的保护作用减弱甚至消失。
结论红景天苷可能通过激活Nrf2-ARE信号通路而减轻神经元细胞凋亡情况，有望成为一种新的PD治疗药物。
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关键词:
- 红景天苷 /
- 核因子E2相关因子2 /
- 抗氧化反应元件 /
- 帕金森病 /
- 细胞凋亡
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of salidroside on1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced Parkinson's disease (PD) in mice.
MethodsC57BL/6J mice were induced by MPTP to establish a PD mouse model and the movement track of mice was recorded by open field experiment. The expression of tyrosine hydroxylase (TH), α-synuclein (α-syn), nuclear factor E2 associated factor 2 (Nrf2) and quinone oxidoreductase 1 (NQO1) were detected by immunohistochemistry in brain tissue of mice. SN4741 cells were stimulated by MPTP to establish a PD cell model in vitro. MPTP stimulation of SN4741 cells to establish an in vitro cell model of PD. After pretreatment with salidroside, TUNEL was used to detect cell apoptosis in each group. The expressions of TH, α-syn, Nrf2 and NQO1 were detected by immunofluorescence. Nrf2 expression was knocked down by being transfected with si-RNA, and apoptosis condition was detected by TUNEL assay. The expression levels of interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-18 (IL-18) protein in brain tissue extract and cell culture were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ResultsThe open field experiment results showed that salidroside could improve 3 min total distance of activity, average speed and activity track of PD mice (P < 0.05). Compared with the PD model mice, the salidroside treated mice showed significantly increased expression of TH, Nrf2 and NQO1 in the brain, and reduced expression of IL-18, α-Syn, IL-1β. Compared with the MPTP stimulated cells, the salidroside pretreatment group showed a decrease in cell apoptosis and an increase in the expressions of TH, Nrf2 and NQO1, but reduced expressions in α-Syn, IL-1β and IL-18. After si-RNA knockdown of Nrf2 expression, the protective effect of salidroside on MPTP stimulated cells weakened or even disappeared.
ConclusionSalidroside may alleviate neuronal apoptosis by activating Nrf2-ARE signaling pathway, which is expected to be a new drug for PD treatment.
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症状性颅内动脉狭窄(sICAS)是指由动脉粥样硬化引起的颅内动脉狭窄，且狭窄动脉供血区域发生过缺血性卒中或短暂性脑缺血发作[1-2]。研究[3-4]显示，1/3~1/2的缺血性卒中病例与sICAS有关。血管内支架置入术作为一种微创治疗方法，因能迅速改善大脑供血、创伤小且安全性较高，已成为治疗sICAS的主要手段[5]。然而，由于颅内血管结构复杂，支架置入过程中可能存在较高的并发症风险[6]。本研究探讨血管内支架置入术治疗sICAS患者的安全性及有效性，以期为sICAS的临床治疗提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取北京京煤集团总医院2021年9月—2023年11月收治的100例sICAS患者作为研究对象。纳入标准: ①经影像学检查确诊sICAS者; ②临床资料完整者; ③签署知情同意书者。排除标准: ①合并颅内动脉瘤、蛛网膜下腔出血等脑血管疾病者; ②严重凝血功能异常者; ③合并精神疾病者; ④过敏体质或存在支架置入禁忌证者。采用随机数字表法将患者分为对照组和研究组，每组50例。对照组男28例，女22例; 年龄41~78岁，平均(62.31±6.52)岁; 体质量指数为(22.64±2.23)kg/m2; 颅内动脉狭窄率为(85.87±4.52)%。研究组男26例，女24例; 年龄43~77岁，平均(61.65±5.57)岁; 体质量指数为(22.51±2.30) kg/m2; 颅内动脉狭窄率为(85.23±5.47)%。2组患者基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 方法
对照组采用规范药物治疗方案: 口服阿司匹林肠溶片(100 mg/次, 1次/d)、氯吡格雷(75 mg/次, 1次/d)抗血小板聚集，口服阿托伐他汀钙片(10 mg/次, 1次/d)降低血脂和稳定斑块，口服氨氯地平等降压药物稳定血压(目标血压为收缩压130~150 mmHg, 舒张压70~80 mmHg, 1 mmHg=0.133 kPa)。
研究组采用血管内支架置入术治疗方案: 术前3 d口服拜阿司匹林(100 mg/次, 1次/d)、氯吡格雷(75 mg/次, 1次/d); 全身麻醉或局部麻醉下，经股动脉穿刺置管，并进行全身肝素化; 通过数字减影血管造影(DSA)确定狭窄血管病变处，并评估狭窄程度; 使用常规微导丝携带微导管至血管病变远端; 将球囊送至狭窄段，进行扩张; 扩张后，置入支架; 支架置入成功后，通过血管造影再次评估狭窄情况; 术后给予患者低分子肝素治疗3 d，并针对危险因素或手术并发症等不良事件采取相应处理措施。
1.3 观察指标
① 2组患者治疗前和治疗后14 d的颅内动脉狭窄率; ② 2组患者治疗前和治疗后14 d的神经功能，采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估，总分42分，评分越高表示神经功能损伤越严重; ③ 2组患者治疗前和治疗后14 d的日常生活能力，采用日常生活活动能力量表(ADL)评估，总分100分，评分越高表示日常生活活动能力越好; ④ 2组患者治疗前与治疗后14 d的脑血流灌注指标，包括狭窄段收缩期峰值流速(PSV)和搏动指数，通过经颅彩色多普勒超声(TCCD)测量; ⑤ 2组患者不良反应发生情况，包括缺血性卒中、出血性卒中及颅内动脉再狭窄等。
1.4 统计学分析
采用SPSS 25.0统计学软件分析数据，计数资料以[n(%)]描述，比较采用χ2检验，计量资料以(x±s)描述，比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 治疗前后颅内动脉狭窄率比较
治疗前, 2组患者颅内动脉狭窄率比较，差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后, 2组患者颅内动脉狭窄率均低于治疗前，且研究组低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 2组患者治疗前后颅内动脉狭窄率比较(x±s)% 组别 n 治疗前 治疗后 对照组 50 85.87±4.52 34.57±6.48* 研究组 50 85.23±5.47 12.32±3.26*# 与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。 2.2 治疗前后神经功能比较
治疗前, 2组患者NIHSS评分比较，差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后, 2组患者NIHSS评分均低于治疗前，且研究组低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 2组患者治疗前后NIHSS评分比较(x±s)分 组别 n 治疗前 治疗后 对照组 50 26.19±5.54 9.91±1.65* 研究组 50 25.42±4.86 5.47±1.28*# NIHSS: 美国国立卫生研究院卒中量表。
与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。2.3 治疗前后日常生活能力比较
治疗前, 2组患者ADL评分比较，差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后, 2组患者ADL评分均高于治疗前，且研究组高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 2组患者治疗前后ADL评分比较(x±s)分 组别 n 治疗前 治疗后 对照组 50 26.68±6.47 48.61±7.87* 研究组 50 27.43±4.51 60.97±6.75*# ADL: 日常生活活动能力量表。
与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。2.4 治疗前后脑血流灌注指标比较
治疗前, 2组患者PSV、搏动指数比较，差异无统计学意义(P>0.05); 治疗后, 2组患者PSV、搏动指数均低于治疗前，且研究组低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 4。
表 4 2组患者治疗前后脑血流灌注指标比较(x±s)组别 n PSV/(cm/s) 搏动指数 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 对照组 50 169.82±27.86 114.34±17.72* 1.78±0.42 1.19±0.23* 研究组 50 167.95±24.34 87.85±14.63*# 1.75±0.34 0.81±0.17*# PSV: 狭窄段收缩期峰值流速。与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。 2.5 不良反应发生情况比较
研究组患者的不良反应发生率低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 5。
表 5 2组患者不良反应发生情况比较[n(%)]组别 n 缺血性卒中 出血性卒中 颅内动脉再狭窄 合计 对照组 50 5(10.00) 1(2.00) 2(4.00) 8(16.00) 研究组 50 2(4.00) 0 1(2.00) 3(6.00)* 与对照组比较, * P < 0.05。 3. 讨论
卒中是导致人类残疾和死亡的主要原因之一，急性缺血性卒中约占全部卒中的80%[7-9], 治疗的关键在于尽早开通阻塞血管，挽救缺血半暗带[10-12]。sICAS是指由动脉粥样硬化引起的颅内动脉狭窄，且在狭窄动脉供血区域发生过缺血性卒中或短暂性脑缺血发作[13-15]。抗血小板治疗和降脂稳定斑块是sICAS的重要治疗手段，但部分患者接受规范药物治疗后仍会出现症状复发或病情进展。此外，口服抗血小板药物起效时间及持续时间较长，短时间内无法重复给药，且可能存在口服药物抵抗等现象，进一步加重了患者及其家属的身心负担及经济压力[16-17]。因此，探寻一种安全有效的治疗方法对于改善sICAS患者的预后具有重要意义。
随着医学技术的不断发展，血管内治疗(如支架置入、狭窄血管段球囊扩张等)已成为开通“罪犯”血管、提高远端血管支配区脑组织血液供应的重要手段，显著提升了sICAS患者的临床疗效[18-20]。目前，颅内动脉支架置入已被广泛应用于颈内动脉狭窄的治疗，并成为神经科研究的热点之一[21-22]。颅内动脉支架置入治疗能在短期内迅速改善大脑供血，为急性卒中的治疗提供了新方向。然而，支架内再狭窄仍是颅内支架置入术后的主要问题之一[23]。李振强等[24]回顾性分析15例重度sICAS患者的颅内支架置入情况，结果显示所有支架一次性释放成功，手术成功率为100%, 患者未出现缺血性卒中、短暂性脑缺血发作和颅内出血等情况，随访影像学资料显示仅1例患者发生支架内再狭窄，表明颅内支架置入治疗的成功率较高，并发症较少，且随访效果良好。
本研究结果显示，研究组患者治疗后颅内动脉狭窄率显著低于对照组，表明支架置入相较于药物治疗可显著降低狭窄率; 研究组患者治疗后NIHSS评分显著低于对照组，表明支架置入相较于药物治疗可显著改善患者神经功能; 研究组患者治疗后ADL评分显著高于对照组，表明支架置入相较于药物治疗可显著改善患者的日常生活活动能力; 研究组患者治疗后PSV和搏动指数显著低于对照组，表明支架置入相较于药物治疗可显著改善患者的脑血流灌注情况; 研究组患者的不良反应发生率显著低于对照组，表明支架置入相较于药物治疗可显著减少不良反应。
综上所述，血管内支架置入术治疗sICAS患者具有良好的有效性，能够显著降低颅内动脉狭窄率，改善患者的神经功能和日常生活活动能力，且安全性较高。
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图 1 各组小鼠的旷场实验结果
A: 旷场实验活动轨迹图; B、C: 旷场内3 min总距离、平均速度(与对照组比较, *P < 0.05; 与MPTP组比较, #P < 0.05)。
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图 2 各组小鼠脑组织TH、α-syn、Nrf2、NQO1、IL-1β和IL-18表达情况
A: TH、α-syn、Nrf2、NQO1表达情况(免疫组化染色法，标尺20 μm); B、C: IL-1β、IL-18表达情况
(与对照组比较, **P < 0.01; 与MPTP组比较, #P < 0.05, ##P < 0.01)。![]()
图 3 各组SN4741细胞TUNEL实验结果和ELISA实验结果
A: 细胞凋亡情况(TUNEL染色法，标尺20 μm); B: IL-1β、IL-18表达(与对照组比较, **P < 0.01; 与MPTP组比较, #P < 0.05, ##P < 0.01)。
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