Role of telomeric repeat-binding factor 2-P53 signal pathway in diabetic cardiomyopathy
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摘要:目的
探讨端粒重复因子2-P53(TRF2-P53)信号通路在糖尿病心肌病(DCM)中的作用。
方法体内研究予以链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制造1型糖尿病小鼠模型, 9周后超声检测明确DCM模型构建成功。小鼠心脏样本采用免疫印迹(WB)检测TRF2表达水平,采用免疫荧光检测P53表达水平。体外研究予以高糖刺激乳鼠心肌细胞,并采用WB检测TRF2表达水平,采用免疫荧光检测P53表达水平。TRF2 siRNA降低乳鼠心肌细胞TRF2的表达后,采用TUNEL检测凋亡情况,采用衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测衰老情况,采用WB检测P53表达水平。
结果体内研究发现,与WT小鼠相比, DCM小鼠TRF2表达下降, P53表达增加。体外研究发现,高糖刺激引起乳鼠心肌细胞TRF2表达下降, P53表达增加。TRF2 siRNA转染降低乳鼠心肌细胞TRF2水平后可促进凋亡和衰老,增加P53表达。
结论TRF2-P53信号通路在DCM中起了重要的调控作用。
Abstract:ObjectiveTo study the role of telomeric repeat-binding factor 2-P53(TRF2-P53) signal pathway in diabetic cardiomyopathy.
MethodsIn vivo study, type 1 diabetes mouse model was induced by intraperitoneal injection of streptozocin(STZ). After 9 weeks, DCM model was successfully established. The expression level of TRF2 in mouse heart samples was detected by Western blot (WB) and P53 by immunofluorescence. In vitro studies, high sugar was given to stimulate the cardiac muscle cells of neonatal mice, TRF2 expression level was detected by WB and P53 expression level was detected by immunofluorescence. TRF2 siRNA was used to reduce the expression of TRF2 in neonatal mice cardiomyocytes, then TUNEL was used to detect apoptosis, SA-β-galactosidase (SA-β-gal) staining was used to detect condition of aging, and P53 expression level was detected by WB.
ResultIn vivo studies found that TRF2 expression decreased and P53 expression increased in DCM mice compared with WT mice. In vitro studies showed that high glucose stimulation caused the decrease of TRF2 expression and the increase of P53 expression in cardiomyocytes of lactating rat. TRF2 siRNA transfection can promote apoptosis and senescence and increase P53 expression after reducing TRF2 level in cardiomyocytes of lactating rat.
ConclusionTRF2-P53 signaling pathway plays an important role in the regulation of DCM.
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Keywords:
- diabetic cardiomyopathy /
- telomeric repeat-binding factor 2 /
- P53 /
- senescence /
- apoptosis /
- insulin /
- glycosylation
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在糖尿病的所有并发症中,糖尿病心肌病(DCM)是导致死亡的重要原因之一[1]。DCM的发病机制尚未完全阐明,其中胰岛素抵抗、糖基化终末产物、过度氧化应激、炎症、心肌纤维化、线粒体脂肪酸氧化增加等可能参与了DCM的发生及发展[2-4]。shelterin复合体在保护端粒完整中起重要作用,其由6个组分组成,其中端粒重复因子2(TRF2)通过抑制ATM激酶DNA损伤途径和非同源性末端接合(NHEJ)、同源介导的双链DNA修复(HDR)2个DNA修复途径的激活,在分裂细胞中保护端粒。此外, TRF2还参与端粒环(t-loop)的形成[5-7]。TRF2在非分裂细胞中,尤其是心肌细胞中的研究非常有限[8]。本研究探讨TRF2在DCM中的作用及其可能的下游靶点,现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
6~8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠及新生C57BL/6小鼠(日龄1~3 d)购自上海杰思捷实验动物有限公司,许可证号为SCXK(沪)2018-0004。本实验通过上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理委员会审批,批件号为SH9H-2021-A572-SB。主要试剂: STZ(Sigma, S0130), TRF2一抗(Thermo Fisher, 4A794.15), P53一抗(abcam, ab183544), cTNT一抗(abcam, ab8295), GAPDH一抗(碧云天, AF0006), TUNEL检测试剂盒(碧云天, C1086), SA-β-gal染色试剂盒(碧云天, C0602), TRF2 siRNA由生工合成。
1.2 研究方法
1.2.1 动物分组及处理方法
将12只C57BL/6小鼠随机均分为WT组和DCM组,每组6只。WT组正常喂养; DCM组腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导建立DCM模型,禁食12 h后按照130 mg/kg的剂量腹腔注射STZ, 使用血糖仪检测随机血糖水平,以随机血糖>16.6 mmol/L定义为DCM建模成功。
1.2.2 乳鼠心肌细胞的分离与分组培养
沿胸骨中线剪开1~3 d乳鼠胸腔后取出心脏,用预冷的PBS清洗干净,而后将心脏剪碎放入无血清DMEM中。吸出心脏组织,加入0.25%胰酶2 mL吹打消化至液体稍浑浊,吸取上清液,第1个2 mL不要后重复上述操作,直至心脏组织被完全消化。将上清液收集到事先准备的加有7 mL有血清DMEM的15 mL离心管中, 1 000转/min离心5 min, 弃上清液,采用有血清的DMEM沉淀重悬, 70 μm滤网过滤后利用差时贴壁法除去成纤维细胞,采用有血清的DMEM重悬心肌细胞,以2 mL/孔或1 mL/孔接种于6孔板或12孔板,置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。
TRF2 siRNA转染实验: 将乳鼠心肌细胞随机分为Ctrl组和TRF2 siRNA转染组, Ctrl组用含10%胎牛血清和双抗的DMEM正常培养, TRF2 siRNA转染组将20 μmol/L TRF2 siRNA溶液用无血清DMEM稀释后加转染试剂混匀,室温孵育10 min, 将孵育好的TRF2 siRNA复合物直接加入培养液中混匀即可。TRF2 siRNA序列为: 正义(5′-3′)为CGAACAGCUGUGAUGAUUAAATT, 反义(5′-3′)为UUUAAUCAUCACAGCUGUUCGTT。
高糖刺激实验: 将乳鼠心肌细胞随机分为NG组、OC组和HG组, NG组用含5.55 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h, OC组用含5.55 mmol/L葡萄糖和27.75 mmol/L甘露醇的培养基培养48 h, HG组用含33.3 mmol/L葡萄糖的培养基培养48 h。
1.2.3 定量聚合酶链反应(qPCR)
DCM小鼠造模成功后12周,取小鼠心脏灌流,灌流下来的心肌细胞用翌圣总RNA提取试剂盒提取RNA, 再用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA, 最后用qPCR SYBR Green Master Mix 20微升体系跑qPCR。引物序列见表 1。
表 1 引物序列引物 序列 TRF2 上游 GCAGAAGATGCTGCGTTTCCTAG 下游 TTTCCACTGGCTCTGGGTGCTT GAPDH 上游 CATCACTGCCACCCAGAAGACTG 下游 ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG 1.2.4 免疫印迹(WB)
心肌细胞直接用碧云天蛋白上样缓冲液提取蛋白,而后用SDS-PAGE配置的凝胶进行电泳,然后转移到PVDF膜上。碧云天Western封闭液封闭1 h后加TRF2、P53、GAPDH一抗(稀释比例为1∶ 1 000), 4 ℃孵育过夜。次日,经TBST洗涤液摇洗后,将膜与相应的酶标二抗(稀释比例为1∶ 1 000)在室温下孵育1 h。采用ECL底物检测试剂盒检测免疫反应条带。采用Image J软件分析条带灰度值,计算目的蛋白相对表达量。
1.2.5 TUNEL染色
乳鼠心肌细胞分为Ctrl组和TRF2 siRNA组分组培养72 h, 具体方法见步骤1.2.2。采用碧云天一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光),严格按照说明书操作。
1.2.6 衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色
乳鼠心肌细胞分为Ctrl组和TRF2 siRNA组分组培养72 h, 具体方法见步骤1.2.2。采用碧云天细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒,严格按照说明书操作。
1.2.7 冰冻切片P53免疫荧光染色
DCM小鼠造模成功后12周,取小鼠心脏制作6 μm厚的冰冻切片,将保存在-80℃的冰冻切片室温放置15~30 min, 4%多聚甲醛固定10 min, PBS浸洗, Blocking buffer室温孵育1 h, 一抗4 ℃过夜孵育。第2天, Blocking buffer洗3次,每次10 min, 二抗室温孵育1 h, Blocking buffer洗2次,每次15 min, PBST洗2次,每次15 min, DAPI(1∶ 500)染色5~10 min, ddH2O水洗3次,每次5 min, 封片,显微镜下观察。
1.2.8 乳鼠心肌细胞爬片P53免疫荧光染色
吸除培养板中的培养液,爬片PBS洗3次,每次3 min。4%多聚甲醛固定30 min, PBS洗3次,每次3 min。Blocking buffer室温孵育1 h, 一抗4 ℃过夜孵育。第2天的操作同冰冻切片P53免疫荧光染色。
1.3 统计学方法
采用GraphPad Prism软件进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,多组间比较采用方差分析,组间比较采用t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 DCM小鼠心肌TRF2表达下降
DCM造模成功后12周,经心脏灌流法提取小鼠心肌细胞, qPCR检测mRNA表达水平, WB法检测蛋白表达水平。qPCR结果显示, DCM小鼠TRF2 mRNA表达水平为(0.76±0.11), 低于WT小鼠的(1.01±0.11), 但差异无统计学意义(P>0.05)。WB结果显示, DCM小鼠TRF2蛋白表达水平为(0.48±0.06), 低于WT小鼠的(1.00±0.15), 差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 1。
2.2 高糖刺激能够引起乳鼠心肌细胞TRF2表达下降
乳鼠心肌细胞分为NG组、OC组和HG组, WB结果显示NG组、OC组的TRF2表达水平分别为(1.81±0.13)、(2.32±0.37),高于HG组的(1.00±0.13), 差异均有统计学意义(P < 0.05), 提示高糖刺激能引起乳鼠心肌细胞TRF2的表达下降。见图 2。
2.3 DCM小鼠心肌P53表达增加
DCM小鼠造模成功后12周, P53免疫荧光染色结果显示, DCM小鼠心肌P53表达水平为(59.76±1.77), 高于WT小鼠的(42.19±2.18), 差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3。
2.4 高糖刺激能够引起乳鼠心肌细胞P53表达增加
将乳鼠心肌细胞分为NG组、OC组和HG组, P53免疫荧光染色结果显示, NG组、OC组P53水平分别为(23.97±3.36)、(25.59±5.79), 均低于HG组的(51.77±0.59), 差异有统计学意义(P < 0.05), 提示高糖刺激可引起乳鼠心肌细胞P53表达增加。见图 4。
2.5 TRF2 siRNA转染引起乳鼠心肌细胞P53表达增加
乳鼠心肌细胞TRF2 siRNA转染72 h后提取蛋白行WB检测,结果显示,与Ctrl组相比, TRF2 siRNA转染组乳鼠心肌细胞TRF2表达下降, P53表达增加,差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 5、表 2。
表 2 Ctrl组与 TRF2 siRNA组乳鼠心肌细胞TRF2、P53表达水平比较(x±s)组别 n TRF2 P53 Ctrl组 3 1.00±0.01 1.00±0.14 TRF2 siRNA组 3 0.36±0.08* 1.59±0.25* 与Ctrl组比较, *P < 0.05。 2.6 TRF2 siRNA转染引起乳鼠心肌细胞凋亡增加
乳鼠心肌细胞TRF2 siRNA转染72 h后收集细胞, TUNEL染色结果显示, TRF2 siRNA组心肌细胞凋亡TUNEL阳性比率为(45.38±3.30)%, 高于Ctrl组TUNEL阳性比率(4.76±0.54)%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 6。
2.7 TRF2 siRNA转染引起乳鼠心肌细胞SA-β-gal染色增加
乳鼠心肌细胞TRF2 siRNA转染72 h后收集细胞, SA-β-gal染色结果显示, TRF2 siRNA组SA-β-gal阳性细胞比率为(55.57±2.52)%, 高于Ctrl组的(14.64±1.34)%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 7。
3. 讨论
DCM是发生在糖尿病患者中的一种严重的不可逆性慢性心血管并发症,表现为心肌纤维化、心肌肥厚、收缩功能不全等,并最终可能进展为心力衰竭[9-11]。目前,针对DCM的诊断和治疗方法仍非常缺乏[12]。TRF2作为shelterin复合体的组成部分,主要发挥端粒保护作用。有关TRF2的研究主要在分裂细胞中开展,在非分裂细胞(如心肌细胞)中的研究仍较少。本研究结果显示, DCM模型中心肌细胞TRF2表达下降,而TRF2下降引起细胞凋亡及衰老。本研究发现DCM小鼠心肌TRF2表达下降,高糖刺激能够引起乳鼠心肌细胞TRF2表达下降, TRF2 siRNA转染引起乳鼠心肌细胞凋亡增加, SA-β-gal染色增加。KARLSEDER J等[13]研究发现,原代淋巴细胞中TRF2抑制可以直接诱导细胞凋亡。在人类细胞中,尤其是成纤维细胞中, TRF2抑制导致衰老而不是细胞凋亡。
研究[13]发现, P53可以作为TRF2的下游靶点,细胞凋亡伴随着P53的稳定和激活,导致其下游P21和Bax的表达增加; 在分裂细胞中,细胞凋亡的启动需要P53的参与,在P53缺乏的人类和小鼠细胞中,细胞凋亡不启动。MARTÍNEZ P等[14]研究显示,在复层上皮细胞中, TRF2条件性敲除激活端粒急性DNA损伤反应(DDR), 导致P53信号通路的激活和细胞的凋亡。STAGNO D′ALCONTRES M等[15]和YANG Q H等[16]研究发现,在肿瘤细胞中, TRF2抑制能引起P53激活和细胞凋亡增加。在非分裂细胞(如心肌细胞)中, TRF2同样可以调控P53的表达。
EGUCHI A等[8]研究显示,人诱导多能干细胞(iPSC)来源的心肌细胞杜氏肌营养不良(DMD)造模后端粒缩短, TRF2表达下降, P53的表达上调。WERNER C等[17]研究显示,运动能够通过增加心肌细胞TRF2的表达来减少阿霉素心肌损伤模型P53激活。GU J L等[18]及NAKAMURA H等[19]研究证实了DCM与P53激活有关。本研究发现DCM小鼠和高糖刺激的乳鼠心肌细胞P53表达增加; 本研究还发现TRF2 siRNA转染后的乳鼠心肌细胞P53激活。据此推测, TRF2-P53信号通路在DCM中发挥了重要的调控作用。
综上所述, TRF2-P53通路激活在DCM中发挥调控作用,可能为DCM的诊治提供新的思路和靶点。
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表 1 引物序列
引物 序列 TRF2 上游 GCAGAAGATGCTGCGTTTCCTAG 下游 TTTCCACTGGCTCTGGGTGCTT GAPDH 上游 CATCACTGCCACCCAGAAGACTG 下游 ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG 表 2 Ctrl组与 TRF2 siRNA组乳鼠心肌细胞TRF2、P53表达水平比较(x±s)
组别 n TRF2 P53 Ctrl组 3 1.00±0.01 1.00±0.14 TRF2 siRNA组 3 0.36±0.08* 1.59±0.25* 与Ctrl组比较, *P < 0.05。 -
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