Study on level of CD56+ CD16+ natural killer cell in patients with repeated implantation failure complicated with chronic endometritis
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摘要:目的
观察合并慢性子宫内膜炎(CE)的反复着床失败(RIF)患者子宫自然杀伤(uNK)细胞的表达水平。
方法选取2018年10月—2023年2月就诊于生殖医学中心的82例RIF患者为RIF组; 选择同期在本中心行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的有IVF助孕妊娠活产史且拟再次助孕的82例患者为对照组。2组均在黄体中期取2份子宫内膜组织，一份采用流式细胞仪检测子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞水平，另一份采用免疫组化方法检测CD138。采集外周血3~4 mL, 采用流式细胞仪检测CD56+CD16+外周血自然杀伤(CD56+CD16+PbNK)细胞水平及血常规。CE阳性患者口服抗生素治疗1个疗程。抗炎治疗结束后下个月经周期黄体期时再次取少量子宫内膜组织，采用免疫组化方法检测CD138。比较治疗前后2组临床妊娠率及胚胎着床率。
结果RIF组CD56+CD16+uNK细胞水平为(34.23±17.01)%, 低于对照组的(45.41±20.90)%, 差异有统计学意义(P < 0.05); RIF组黄体中期外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平为(14.38±5.36)%, 与对照组的(13.58±4.34)%比较, 差异无统计学意义(P>0.05); RIF组与对照组白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞水平与外周血CD56+CD16+PbNK细胞水平无相关性(r=0.06)。RIF组合并CE与无合并CE、对照组合并CE与无合并CE的黄体中期内膜中CD56+CD16+uNK细胞、外周血中CD56+CD16+PbNK细胞水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。在RIF组合并CE及对照组合并CE患者中，治疗后CE转阴者较CE仍为阳性者的临床妊娠率、着床率均升高，早期流产率降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。
结论CD56+CD16+uNK细胞低表达可能导致母胎界面免疫紊乱，从而增加RIF发生的风险; 外周血CD56+CD16+PbNK细胞与子宫内膜CD56+CD16+uNK细胞无相关性; 抗生素治疗CE能明显改善RIF患者妊娠结局, CE的确诊和治疗应作为RIF评估的重要因素。
Abstract:ObjectiveTo observe the expression level of uterine natural killer (uNK) cell in patients with repeated implantation failure (RIF) complicated with chronic endometritis (CE).
MethodsA total of 82 RIF patients treated in the Reproductive Medicine Center from October 2018 to February 2023 were selected as RIF group; 82 cases with history of IVF-assisted pregnancy and willing of assisted pregnancy again in the same period who underwent in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) in the center were selected as control group. Two samples of endometrial tissues were taken from both groups during the mid-luteal phase, one sample was used for detection of endometrial CD56+CD16+ uNK cell level by flow cytometry, and another sample was used for detection of CD138 by immunohistochemistry. A sample of 3 to 4 mL peripheral blood was collected, and flow cytometry was used to detect the level of CD56+CD16+ peripheral blood natural killer (CD56+CD16+PbNK) cell and blood routine. Patients with positive CE were asked to take a course of oral antibiotic therapy. In the luteal phase of the next menstrual cycle after the end of anti-inflammatory treatment, a small amount of endometrial tissues was taken again, and CD138 was detected by immunohistochemistry. Clinical pregnancy rate and embryo implantation rate before and after treatment were compared between the two groups.
ResultsThe level of CD56+CD16+uNK cell was (34.23±17.01)% in the RIF group, which was significantly lower than (45.41±20.90)% in the control group (P < 0.05); the level of CD56+CD16+PbNK cell in the peripheral blood of the mid-luteal phase in the RIF group was (14.38±5.36)%, which showed no significant difference compared to (13.58±4.34)% in the control group (P>0.05); there were no significant differences in white blood cell count, lymphocyte percentage, and neutrophil percentage between the RIF group and the control group (P>0.05). There was no correlation between the level of endometrial CD56+CD16+uNK cell and the level of CD56+CD16+PbNK cell in peripheral blood (r=0.06). There were no significant differences in the levels of endometrial CD56+CD16+uNK cell and peripheral blood CD56+CD16+PbNK cell in mid-luteal phase between cases with CE and without CE in the RIF group and the control group (P>0.05). In the patients complicating CE in the RIF group and the control group, the clinical pregnancy rate and implantation rate of cases with negative CE after treatment were significantly higher than those with positive CE after treatment, while the early abortion rate of cases with negative CE after treatment was significantly lower (P < 0.05).
ConclusionLow expression of CD56+CD16+uNK cell may lead to immune disorders at the maternal-fetal interface, thereby increasing the risk of RIF; there is no correlation between peripheral blood CD56+CD16+PbNK cell and endometrial CD56+CD16+uNK cell; antibiotic treatment for CE can significantly improve the pregnancy outcome of RIF, and the diagnosis and treatment of CE should be considered as an important factor in the evaluation of RIF.
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近年来，内镜黏膜下剥离术(ESD)已成为早期食管癌及食管癌前病变的首选治疗方法[1-3], 但ESD后狭窄则是困扰手术医生的难题。本研究在治疗过程中应用Hook刀对狭窄部位行内镜下放射状切开术(ERI)治疗，取得了满意的疗效，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年11月—2021年2月苏北人民医院收治的食管ESD后狭窄患者11例为研究对象，均行ERI治疗，其中男7例，女4例，年龄62~81岁，平均(69.1±6.2)岁。纳入标准: ①根据病史、临床表现、胃镜检查证实为ESD后狭窄者; ②钡餐或碘剂造影显示狭窄病变长度<5.0 cm, 且为单一狭窄段; ③切开术前曾接受≥3次的扩张或其他治疗、治疗无效或短期内复发者[4-6]; ④完善术前检查及生化、凝血常规、影像学检查者，术前未长期服用抗凝药者，无手术绝对禁忌证者。排除标准: ①合并严重心肺疾病者及存在脏器功能衰竭者; ②身体状况不能耐受手术者。
1.2 手术相关设备
Olympus 290主机及Olympus Q260J治疗内镜, KD-620-LR型Hook刀, FD-1U-1热活检钳, ERBE ICC-200高频电切装置, CO2气泵系统，南京微创ROCC-D-26-195和谐夹。ERBE ICC-200高频电切装置参数: ①内镜电切采用Q模式，效果3、宽度2、间隔4, 功率45 W; ②采用强力电凝模式，效果2, 功率50 W[7]。
1.3 患者围术期护理、内镜操作及配合
1.3.1 术前护理
拟行手术的患者基本都经历过多次内镜下治疗，患者对手术存在恐惧、焦虑等情况，护理人员应充分向患者讲解手术的目的以及术后可能获得的收益; 当发生并发症时，应采取积极的措施以消除患者的恐惧感、紧张感，使患者能在良好的状态下接受手术。患者术前完善入院常规检查，签署内镜治疗同意书，嘱咐患者术前禁食8 h、禁水4 h, 详细询问患者是否仍在服用抗凝药物，为避免术后迟发性出血，应停药5 d后再行手术。
1.3.2 术中护理
核对患者信息，协助患者取左侧屈膝位，连接监护仪以及吸氧、负压吸引装置，连接内镜治疗的各种器械设备。手术全程在静脉麻醉下(丙泊酚联合依托咪酯)进行。
1.3.3 术中操作配合
手术医生在内镜直视下进入食管腔内，到达狭窄部位后使用注水泵灌注灭菌注水用水，充分清洗管腔，观察狭窄部位形态，充分评估后采用Hook刀在内镜直视下沿狭窄部位纵轴推进切开疤痕，深度以切口底端到达口侧及肛侧正常食管黏膜连线构成的虚线水平或达固有肌层表层为佳。切开过程中，器械护士应始终保持Hook刀头朝向食管腔内，术中注意协助医生观察有无局部活动性出血及穿孔等，少量出血可予以热活检钳电凝止血。密切观察患者生命体征的变化情况，包括血压、心率、血氧饱和度、气道压以及颈部皮下气肿等。
1.3.4 术后护理
① 术毕时患者入复苏室，观察其神志，监测患者生命体征。待患者完全清醒后送回病房。患者取半卧位，连接心电监护仪并吸氧。嘱患者绝对卧床休息，变换体位要轻柔。②术后24 h内绝对禁食，可服用医嘱给予的硫糖铝混悬液及康复新液，保护局部黏膜，避免胃酸反流烧灼创面; 24 h后若无明显不适及并发症，可指导患者进食少量温流质饮食; 48 h后可进食半流质饮食; 72 h后可进食少渣软食，忌辛辣、刺激性饮食，减少食物对创面的刺激。③遵照医嘱给予患者抑酸剂、止血药物、黏膜保护剂治疗，术后24 h内给予适量补液治疗，随着进食改善可减少补液量。加强病房巡视，密切观察患者有无药物不良反应。④患者术后可能出现咽部不适、疼痛等症状，考虑为手术过程中内镜反复出入而摩擦咽部导致，一般无需特殊处理可自行好转，部分症状严重者可给予康复新液含漱。患者可能出现胸痛症状，考虑为术后创面疼痛，绝大多数症状较轻，可不予处理; 疼痛严重而影响睡眠者，可给予小剂量消炎痛栓塞肛以缓解症状。若患者出现呕吐症状，需注意观察呕吐物性质，若为咖啡色液体，除考虑术中少量出血由胃内反流呕出外，还需注意是否存在术后迟发性渗血; 若呕吐物为鲜红色血液，应考虑术后迟发性出血可能，应立即向医生汇报，必要时行内镜下止血治疗。若患者出现心率加快、血氧饱和度下降、颈部皮下气肿或呼吸困难时，应立刻考虑穿孔的可能，立即向医生汇报，同时完善术前准备，及早开展手术治疗。⑤根据患者的学历、知识水平、理解能力采取有针对性的出院指导，嘱咐患者避免进食干硬、辛辣、刺激性食物，以少渣软食为主，少食多餐。若进餐过程中突然出现进食梗阻症状，应立即来院行内镜下检查。⑥建立ERI患者档案，出院后1周回访患者恢复情况，并做好记录。术后1、3、6个月通知患者来院复查胃镜。
1.4 观察指标
评估患者手术前后吞咽困难的改善情况，采用吞咽困难评分表进行评估, 0分为正常进食, 1分为可进食部分固体, 2分为半流质饮食, 3分为只能进食液体, 4分为完全不能进食[6], 评估时点为ERI术前、术后5 d以及术后3、6个月。记录患者的手术时间、出血和穿孔情况以及术后因疼痛需药物治疗情况。
1.5 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，不同时点比较采用F检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
11例患者均成功完成ERI, 平均狭窄长度为(2.72±1.48) cm, 平均手术时间为(25.45±16.00) min; 2例患者出现术中渗血，经热活检钳止血成功; 4例患者术后有胸骨后隐痛，未使用镇痛药物治疗, 48~72 h后自行缓解。11例患者均未出现严重胸痛、感染、迟发性出血、穿孔、食管瘘或中转外科手术治疗等情况。术后随访6~24个月，平均13.9个月，所有患者吞咽困难症状较术前好转，见表 1。
表 1 11例患者手术前后狭窄处直径及吞咽困难评分比较(x±s)时点 狭窄处直径/cm 吞咽困难评分/分 ERI术前 0.34±0.14 3.09±0.54 术后5 d 1.26±0.19 1.18±0.60 术后3个月 1.16±0.22 1.45±0.69 术后6个月 1.14±0.20 1.80±0.98 F 19.190 18.970 P <0.001 <0.001 3. 讨论
研究[8-10]表明，若食管剥离面积超过3/4环周, ESD后食管狭窄发生率可高达66%~90%; 若食管剥离面积为全环周, ESD后食管狭窄发生率几乎为100%[11-12]。食管黏膜剥离长度>3.0 cm也是导致食管狭窄的危险因素[13]。目前, ESD后食管狭窄的机制仍不明确，考虑与黏膜切除后缺损部位的炎性反应以及愈合过程中的疤痕组织增生、纤维化有关[14], 其中疤痕组织增生、纤维化是导致食管ESD后狭窄的主要原因[15-16]。临床上治疗ESD后狭窄的方法包括内镜下药物注射(糖皮质激素或丝裂霉素)、球囊扩张、探条扩张等，而本研究采用的ERI治疗食管ESD后狭窄取得了良好的疗效。
ESD后疤痕狭窄导致的组织纤维化使术中无法有效进行黏膜下注射，因此使用Hook刀切开的过程中风险会更大，不仅需要医生能熟练掌握ESD操作技术，而且还需要护士的操作配合。护士需提前设置好适当的电外科参数，术中时刻注意掌握Hook刀的出刀方向，根据手术医生的要求变换不同的角度，一般以刀头方向朝向食管腔，避免刀头反向损伤食管肌层而导致穿孔的发生; 注意观察术中有无出血表现，若为少量渗血，可予以8%去甲肾上腺素液冲洗; 若为小血管渗血，可予以Hook刀弓部电凝止血; 若为小动脉搏动性出血，则需立即换用热活检钳找准出血血管断端充分电凝; 搏动性出血多迅猛，护士需要反应迅速并妥善操作处理。此外，还需观察患者生命体征的变化，若发现颈部皮下气肿、气道压增高且持续存在，应立即提醒手术医生患者存在穿孔的可能，尽早发现穿孔部位，并立即予以钛夹夹闭。
规范的围术期护理能提高患者手术安全性，术前护理应充分了解患者有无手术禁忌证、有无使用抗凝药物等可能导致术后迟发性出血的因素，而完善的术前心理护理能让患者及家属充分了解手术的收益，促使患者以平和的心态完成手术。术后应安排适宜的体位，采取半卧位，床头抬高30~45 °, 以防止胃酸反流损伤手术创面。医护还应指导患者饮食，术后24 h后可进食温流质饮食, 48 h后进食半流质饮食, 72 h后可进食少渣软食。严密观察患者的生命体征变化及病情的改变，及早发现并识别并发症，加强心理疏导，积极实施健康教育，随时根据患者病情调整宣教内容，术后持续跟踪调查，减少疾病复发，促进患者康复。
综上所述, ERI用于食管ESD后狭窄的治疗是安全有效的，术中医护间的默契配合能提高患者手术安全性，围术期规范护理则能促进患者康复。
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图 1 显微镜下不同放大倍数免疫组化检测CD138的表达与定位(SP法)
A: 放大400倍表现; B: 放大200倍表现; C: 放大100倍表现。深棕色染色为阳性反应。
表 1 2组患者一般资料比较(x±s)
一般资料 RIF组(n=82) 对照组(n=82) 年龄/岁 33.31±4.56 33.49±4.78 不孕年限/年 5.12±1.89 4.89±1.13 基础卵泡/个 9.92±1.65 9.38±2.72 基础FSH/(mIU/mL) 5.48±1.68 5.81±2.54 基础LH/(mIU/mL) 4.56±2.54 4.32±1.67 基础E2/(pg/L) 61.34±28.12 62.80±31.23 基础P/(ng/mL) 0.32±1.28 0.38±2.01 FSH: 促卵泡激素; LH: 促黄体生成素; E2: 雌二醇; P: 孕酮。 
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表 2 2组免疫细胞水平及外周血血常规指标比较(x±s)
指标 RIF组(n=82) 对照组(n=82) CD56+CD16+uNK/% 34.23±17.01* 45.41±20.90 CD56+CD16+PbNK/% 14.38±5.36 13.58±4.34 白细胞计数/(×109/L) 5.88±1.45 5.98±1.38 淋巴细胞百分比/% 20.80±3.89 21.71±2.93 中性粒细胞百分比/% 57.17±9.51 58.43±9.16 与对照组比较, * P < 0.05。
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表 3 RIF组及对照组组内合并与无合并CE时免疫细胞水平比较(x±s)
组别 分类 n CD56+CD16+uNK/% CD56+CD16+PbNK/% RIF组(n=82) 合并CE 42 32.12±14.55 14.97±3.12 无合并CE 40 36.40±20.18 13.72±5.28 对照组(n=82) 合并CE 44 46.47±22.93 13.83±4.69 无合并CE 38 44.98±20.11 13.29±5.91
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表 4 2组CE治疗后妊娠结局比较(x±s)[n(%)]
妊娠结局 RIF组合并CE(n=42) 对照组合并CE(n=44) 治疗后转阴(n=32) 治疗后仍为阳性(n=10) 治疗后转阴(n=39) 治疗后仍为阳性(n=5) 年龄/岁 32.80±7.53 33.34±5.51 33.12±8.34 33.86±9.16 移植日内膜厚度/cm 8.90±1.33 8.77±1.61 9.54±1.39 9.59±1.61 平均移植胚胎数/个 1.94 2.00 1.79 1.80 临床妊娠 11(34.38)* 2(20.00) 28(71.79)* 3(60.00) 着床 14(22.58)* 3(15.00) 37(52.86)* 4(44.44) 早期流产 2(18.18)* 1(50.00) 2(7.14)* 1(33.33) 着床: RIF组合并CE患者中，治疗后转阴者总移植胚胎数为62个，治疗后仍为阳性者为20个; 对照组合并CE患者中，治疗后转阴者总移植胚胎数为70个，治疗后仍为阳性者为9个。与同组治疗后仍为阳性比较, * P < 0.05。
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