Clinical analysis of transnasal endoscopic low temperature plasma radiofrequency ablation in treatment of children with snoring
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摘要:目的
探讨经鼻内镜低温等离子消融术治疗小儿鼾症的疗效及术后并发症。
方法回顾性分析278例小儿鼾症的临床资料，根据手术方式不同分为对照组128例和观察组150例，对照组采用腺样体刮除术以及双侧扁桃体剥离术治疗，观察组采用经鼻内镜低温等离子消融术治疗。比较2组围术期指标、视觉模拟疼痛量表(VAS)评分、炎性因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-8(IL-8)]、应激反应指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)]、通气功能指标[呼吸紊乱指数(AHI)、氧减指数(ODI)、最长呼吸暂停时间(LAT)、最低夜间血氧饱和度(LSaO2)]、匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)评分及并发症发生率。
结果观察组手术时间、症状缓解时间、住院时间均短于对照组，术中出血量少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后6、24、48、72 h的VAS评分均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。术后3 d, 观察组血清TNF-α、IL-4、IL-8水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 术后24 h, 观察组血清MDA低于对照组, SOD、GSH高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 术后6个月，观察组AHI、ODI、LAT水平均低于对照组, LSaO2高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05); 术后6个月，观察组PSQI评分、并发症发生率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。
结论经鼻内镜低温等离子消融术可降低小儿鼾症炎症因子水平，减轻应激反应，改善通气功能，提高睡眠质量，且安全性高。
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关键词:
- 小儿鼾症 /
- 经鼻内镜低温等离子消融术 /
- 通气功能 /
- 睡眠质量
Abstract:ObjectiveTo explore the efficacy and postoperative complications of transnasal endoscopic low temperature plasma radiofrequency ablation in the treatment of children with snoring.
MethodsClinical materials of 278 children with snoring were analyzed retrospectively, and they were divided into control group (n=128) and observation group (n=150) according to different operation methods. The control group was treated with adenoidectomy and bilateral tonsillectomy, while the observation group was treated with transnasal endoscopic low temperature plasma radiofrequency ablation. Perioperative indicators, the Visual Analogue Scale (VAS) score, inflammatory factors [tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) and interleukin-8 (IL-8)], stress response indicators [malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH)], ventilation function indicators [apnea hyponea index (AHI), oxygen desaturation index (ODI), the longest apnea time (LAT) and nocturnal lowest blood oxygen saturation (LSaO2)], the Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI) score and the incidence of complications were compared between the two groups.
ResultsIn the observation group, the operation time, symptom relief time and hospital stay were significantly shorter than those in the control group, while the intraoperative bleeding volume was significantly less than that in the control group (P<0.05). The VAS scores of the observation group at 6, 24, 48 and 72 h after operation were significantly lower than those of the control group (P<0.05). At 3 days after operation, serum TNF-α, IL-4 and IL-8 levels in the observation group were significantly lower than those in the control group (P<0.05); at 24 hours after operation, serum MDA level in the observation group was significantly lower than that in the control group, while the levels of SOD and GSH were significantly higher than those in the control group (P<0.05); at 6 months after operation, AHI, ODI and LAT in the observation group were significantly lower than those in the control group, while the LSaO2 was significantly higher than that in the control group (P<0.05); at 6 months after surgery, the PSQI score and incidence of complications in the observation group were significantly lower than those in the control group (P<0.05).
ConclusionTransnasal endoscopic low temperature plasma radiofrequency ablation can reduce the levels of inflammatory factors, alleviate stress response, improve ventilation function, improve quality of sleep in children with snoring, and its safety is relatively high.
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岛素依赖[1]。研究[2]表明, B细胞在自身免疫性糖尿病中发挥着不可替代的作用。B细胞消耗性抗体利妥昔单抗可延迟近期发病患者的T1DM进展。程序性死亡受体配体1(PD-L1)被认为是调节性B细胞的重要特征，其可通过与程序性死亡受体-1(PD-1)的直接相互作用调节免疫应答[3]。研究[4]表明, PD-L1阻断加速了非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病发病，提示PD-L1在T1DM中具有关键的保护作用。本课题组既往研究[5]发现，T1DM患者血清中的可溶性PD-L1水平降低。虽然B细胞的自身抗原递呈被认为可以启动自身免疫，但目前尚不清楚B细胞上的PD-L1是否参与了T1DM的发生。相关研究[6]表明，自身免疫性糖尿病患者循环中B细胞的频率发生了改变。本研究深入探讨这些B细胞，以期能更好地了解T1DM患者循环B细胞中PD-L1的表达。
1. 资料与方法
1.1 样本收集
本研究收集了2023年在苏州大学附属第二医院内分泌科就诊的患者血样。T1DM的诊断标准参照参考文献[7]。患者来自T1DM的各个阶段(T1DM组, n=25)。选取年龄、性别与T1DM患者相匹配的健康人群(健康对照组, n=25)。此外，健康人群自述健康，并经口服葡萄糖耐量试验(OGTT)证实无糖尿病，所有糖尿病自身抗体阴性，同时除外炎症、传染病、癌症或任何其他自身免疫性疾病。参与者知情并同意本研究。本研究已获得苏州大学附属第二医院伦理审查委员会批准。
1.2 临床指标收集
记录受试者的年龄、性别和病程等信息。检测肌酐(Cr)、尿素(BUN)、尿酸(UA)、白蛋白/肌酐(ACR)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹c肽(FCP)。采用放射配体法检测胰岛自身抗体[谷氨酸脱羧酶自身抗体(GADA)、胰岛素瘤相关抗原2自身抗体(IA-2A)、锌转运蛋白8自身抗体(ZnT8A)]。
1.3 流式细胞术
通过静脉穿刺收集受试者4 mL外周血样本，采集的真空管中含有EDTA抗凝。在50 μL全血中加入异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、降钙素原(PCT)和藻蓝蛋白(APC)标记的抗人单抗，并以相应荧光标记的IgG1或IgG2作为同型对照。具体标色方案为: ① CD19-PE，PD-L1-FITC; ② CD19-PE，CD27-APC，PD-L1-FITC; ③ CD19-PE, CD5-APC, CD1d-PCT，PD-L1-FITC; ④ CD19-PE，CD21-APC, CD23-PCT, PD-L1-FITC。在室温避光孵育30 min后，用Beckman Coulter OptiLyse C裂解液进行红细胞溶解和细胞固定。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次后，取细胞悬液(500 μL/次)，用COULTER Epics XL流式细胞仪(Beckman COULTER)检测。
1.4 统计学分析
流式细胞仪数据采用FlowJo软件进行分析。使用IBM SPSS 22.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。所有符合正态分布定量数据均以(x±s)表示。PD-L1在T1DM组和健康对照组之间的差异表达采用双侧t检验进行统计学分析。其他连续变量比较采用Mann-Whitney U检验。采用Pearson相关分析或Spearman非参数相关分析探讨PD-L1水平与其他指标的相关性。双侧P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组B细胞和B细胞亚群表达
采用流式细胞术检测外周血CD19+细胞(B细胞)。T1DM组和健康对照组的B细胞频数比较，差异无统计学意义(P=0.08)。流式细胞术在外周血样本中识别出6个主要的CD19+ B细胞亚群: 幼稚B细胞(CD19+CD27+)、记忆B细胞(CD19+CD27+)、B10 (CD19+CD5+CD1d+)、边缘区B细胞(MZB)(CD19+CD23-CD21+)、滤泡B细胞(FoB)(CD19+CD23+CD21-)和过渡性T2-边缘区前体B细胞(T2-MZP)(CD19+CD23+CD21+)。T1DM组和健康对照组的B细胞亚群频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在T1DM患者中，B细胞亚群的频率无系统性差异。见图 1。
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图 1 T1DM和健康对照组受试者的B细胞和B细胞亚群表达A: B细胞; B: 记忆B细胞; C: 幼稚B细胞; D: B10细胞; E: MZB细胞; F: FoB细胞; G: T2-MZP细胞。2.2 B细胞亚群上PD-L1的表达
与健康对照组的(14.06±5.72)相比, T1DM组CD19+细胞上PD-L1的表达频率为(6.51±3.92), 差异有统计学意义(P＜0.05)。T1DM组患者CD19+CD27+细胞上PD-L1表达为(13.43±10.45), CD19+CD27-细胞上PD-L1表达为(11.17±7.69); 健康对照组CD19+CD27+细胞上PD-L1表达为(23.57±9.81), CD19+CD27-细胞上PD-L1表达为(15.59±6.14)。T1DM组CD19+CD27+细胞、CD19+CD27-细胞上PD-L1的表达频率低于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.05), 见图 2、图 3。2组PD-L1在B10[T1DM组为(18.15±8.48), 健康对照组为(23.44±17.75), P=0.19]、MZB[T1DM组为(19.71±12.89), 健康对照组为(21.22±8.04), P=0.62]和FoB[T1DM组为(41.50±24.15), 健康对照组为(41.77±23.08), P=0.97]细胞上的频率比较，差异无统计学意义。T1DM组PD-L1在T2-MZP细胞中表达频率(35.48±18.17)低于健康对照组(44.92±14.62), 差异有统计学意义(P=0.048 6), 见图 4、图 5。
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图 2 CD19+细胞表面PD-L1表达的流式细胞分析A: CD19+ B细胞的门控策略; B: CD19+细胞中PD-L1表达的门控策略; C: T1DM组与健康对照组CD19+ B细胞上PD-L1的表达比较。每个点代表个体PD-L1的百分比，水平线表示平均值。![]()
图 3 CD19+CD27+和CD19+CD27-细胞表面PD-L1表达的流式细胞术分析A: CD19+CD27+和CD19+CD27-细胞中PD-L1表达的门控策略; B: T1DM组与健康对照组CD19+ CD27+细胞上PD-L1的表达比较; C: T1DM组与健康对照组PD-L1在CD19+ CD27-细胞上的表达比较。![]()
图 4 CD19+CD5+CD1D+细胞表面PD-L1表达的流式细胞术分析A: CD19+CD5+CD1D+细胞中PD-L1表达的门控策略; B: T1DM组与健康对照组CD19+CD5+CD1D+细胞上PD-L1的表达比较。每个点代表个体PD-L1的比例。水平线表示平均值。![]()
图 5 MZB、FoB和T2-MZP B细胞上PD-L1表达的流式细胞分析A: FoB、T2-MZP和MZB细胞中PD-L1的门控策略; B、C、D: T1DM组与健康对照组FoB、T2-MZP和MZB细胞上PD-L1的表达比较。每个点代表个体的PD-L1比例，水平线表示平均值。2.3 临床特征与B细胞亚群PD-L1的相关性
T1DM患者的临床特征见表 1。MZB细胞表面PD-L1表达与BUN呈正相关(P＜0.01); FoB细胞表面PD-L1表达与LDL水平呈负相关(P=0.016), 与HDL水平无相关性(P=0.268), 见表 2。
表 1 T1DM患者临床特征(n=25)(x±s)[M(IQR)]临床特征 数值 女性例数 12 胰岛自身抗体阳性例数 18 病程*/年 4.00(6.00) 高密度脂蛋白/(mmol/L) 1.54±0.68 低密度脂蛋白/(mmol/L) 2.61±1.01 胆固醇/(mmol/L) 4.42±1.43 甘油三酯*/(mmol/L) 0.77(0.57) 丙氨酸氨基转移酶/(U/L) 18.28±15.03 天冬氨酸转移酶/(U/L) 17.84±8.15 肌酐/(μmol/L) 56.04±14.19 尿素/(mmol/L) 4.88±1.53 尿酸/(μmol/L) 254.00±97.49 空腹血糖/(mmol/L) 9.80±4.85 空腹c肽*/(ng/mL) 0.08(0.34) 糖化血红蛋白/% 8.28±2.59 尿微量白蛋白肌酐比*/(mg/g) 11.45(12.50) *数据以中位数(四分位数间距)表示。 表 2 B细胞亚群PD-L1水平与临床特征之间的相关性指标 CD19+CD27+ CD19+CD27- B10 MZB FoB T2-MZP 女性 0.061 0.178 0.308 -0.233 -0.033 -0.044 胰岛自身抗体 0.259 0.080 0.178 0.074 0.321 0.012 病程 -0.114 0.196 -0.080 0.078 -0.138 -0.12 高密度脂蛋白 -0.31 0.024 0.287 0.101 -0.23 0.033 4 低密度脂蛋白 -0.062 -0.007 -0.133 -0.124 -0.477 -0.384 胆固醇 -0.042 -0.047 0.021 -0.075 -0.316 -0.163 甘油三酯 -0.011 0.115 0.022 -0.192 -0.325 -0.227 丙氨酸氨基转移酶 -0.017 0.128 0.095 -0.138 -0.296 -0.311 天冬氨酸转移酶 -0.067 0.156 0.11 -0.211 -0.333 -0.317 肌酐 0.097 0.022 -0.17 0.339 0.145 0.019 尿素 0.166 0.129 -0.108 0.619 0.138 0.199 尿酸 0.161 -0.089 -0.045 0.122 0.055 -0.125 空腹血糖 -0.017 -0.068 0.225 -0.188 0.273 0.048 空腹c肽 -0.041 -0.214 -0.212 0.320 0.330 0.214 糖化血红蛋白 -0.093 -0.130 -0.326 -0.259 0.104 -0.149 尿微量白蛋白肌酐比 -0.219 -0.335 0.109 -0.218 -0.120 -0.229 MZB: 边缘区B细胞; FoB: 滤泡B细胞; T2-MZP: 过渡性T2-边缘区前体B细胞。 3. 讨论
B细胞通过体液免疫直接发挥作用，并作为关键抗原提呈细胞在T细胞介导的自身免疫性糖尿病的启动过程中发挥作用[8]。研究[9]发现, T1DM患者的胰岛功能和血糖水平与B细胞亚群相关。自身免疫性糖尿病与抗PD-1/PD-L1抗体治疗有关，研究[10-11]表明T1DM患者CD4+ T细胞中PD-1的表达显著降低，表明PD-1/PD-L1通路在T1DM中对破坏β细胞起关键作用。本研究旨在探讨T1DM患者外周血中不同B细胞亚群上PD-L1的表达情况。本研究的主要发现为T1DM患者外周血B细胞，尤其是T2-MZP B细胞和记忆B细胞上PD-L1的表达水平降低。
B细胞在T1DM发生发展中的重要性已经在NOD小鼠中得到证实，缺乏B细胞的NOD小鼠不会发生T1DM[12]。同样，通过抗CD20单克隆抗体选择性消耗B细胞，可防止糖尿病的发生[2]。提示B细胞在T1DM的发生发展中有重要作用。B细胞亚群在免疫调节方面也发挥了重要作用，调节性B细胞通过白细胞介素-10 (IL-10)依赖的方式调节T细胞应答，在炎症、感染和自身免疫性疾病中发挥调节功能[13]。MZB细胞和FoB细胞作为重要的抗原递呈细胞，尤其是抗原特异性抗原递呈细胞，能够有效激活并促进CD4+ T细胞增殖[14]。自身抗原通过Toll样受体(TLR)激活B细胞，通过FasL诱导致病性T细胞凋亡，并通过分泌TGF-β抑制抗原递呈细胞的功能来破坏免疫耐受。本研究发现, CD19+ B细胞频率在T1DM组和健康对照组中无显著差异，这与既往研究结果相一致。本研究中, B细胞亚群频率在T1DM组和健康对照组中无显著差异。有研究[9]表明，与健康对照组和2型糖尿病(T2DM)患者相比, T1DM或LADA患者MZB细胞百分比增加，FoB细胞百分比降低。研究人群数量不足可能是导致这种差异的原因。
本研究还关注了B细胞上PD-L1的表达。PD-1/PD-L1在T细胞上的研究较多，在B细胞上的研究较少，但已知PD-1及其配体PD-L1可参与调节B细胞功能[15]。一项研究[16]表明, Treg上PD-1上调需要B细胞上PD-L1的表达，即B细胞通过PD-L1向Treg提供激活信号，从而抑制免疫应答。同时, B细胞可通过上调PD-L1的表达，抑制自身免疫病中的炎症反应，高表达PD-L1的B细胞通过减弱T细胞的活化和抗体的产生[17]而显著抑制体液反应。相反，缺乏PD-L1可能向T细胞提供抑制信号，导致免疫应答的激活。本研究发现, T1DM患者CD19+ B细胞上PD-L1的表达低于健康对照组，提示PD-L1的表达减低，导致对免疫应答的抑制减弱，进而导致了T1DM的发生。除总B细胞(CD19+)外，本研究还评估了B细胞亚群上PD-L1的表达。研究发现，与健康对照组相比，初始B细胞上的PD-L1表达无差异，但记忆性B细胞上的PD-L1表达较低。已有研究[18]表明，记忆性B细胞比初始B细胞反应更快、更剧烈。首先，记忆性B细胞比初始B细胞被更早招募进入分裂，经历更多的分裂轮数；其次，记忆B细胞具有更多细胞表面受体，如CD21、CD27和TACI, 这使得记忆B细胞能够更快、更迅速地对共刺激信号做出反应[19-20]; 再次，记忆性B细胞表达高水平的CD80和CD86, 这有助于向辅助性T细胞寻求帮助。因此提出以下假设: 由于PD-L1的表达水平减低，使记忆B细胞在T1DM的发病机制中发挥了更强的作用。
研究[21]表明，产生IL-10的B细胞(Breg)在T1DM的启动中发挥着不可或缺的作用。相关研究[22-23]在胶原诱导的关节炎小鼠模型中，发现分泌IL-10的B细胞表型为CD21+ CD23+。Breg细胞可以通过增加PD-L1的表达来抑制自身免疫病中的炎症反应[17]。因此, Breg细胞上PD-L1表达的降低可能促进自身免疫性糖尿病的炎症反应。本研究纳入的B细胞亚群中，只有T2-MZP上的PD-L1表达降低。这表明抑制T1DM中炎症的Breg可能是T2-MZP。探究B细胞亚群PD-L1水平与临床特征之间的相关性时，发现PD-L1在FoB细胞上的表达与LDL呈负相关，与既往研究[24]中血糖、血脂与免疫细胞相关的结果一致。
综上所述, T1DM患者B细胞表面PD-L1的表达频率较健康对照组低。PD-L1可能在T1DM的发病中起保护作用。PD-L1高表达的B细胞可能为自身免疫性糖尿病的治疗提供新的有效策略。但本研究存在一定局限，本研究未检测到IL-10和TGFb等炎性细胞因子，因此无法直接探讨PD-L1对B细胞功能的影响，还需进一步深入研究。
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表 1 2组围术期指标(x±s)
组别 n 手术时间/min 术中出血量/mL 症状缓解时间/d 住院时间/d 对照组 128 42.70±7.38 32.73±6.04 9.44±4.08 7.52±2.46 观察组 150 25.67±4.55* 12.80±3.17* 6.12±2.04* 5.30±1.41* 与对照组比较, *P<0.05。 
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表 2 2组VAS评分(x±s)
分 组别 n 术后6 h 术后24 h 术后48 h 术后72 h 对照组 128 6.85±1.14 5.60±0.74 4.02±0.58 3.55±0.41 观察组 150 4.17±0.55* 3.30±0.35* 2.88±0.25* 2.56±0.13* VAS: 视觉模拟疼痛量表。与对照组比较, *P<0.05。
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表 3 2组炎性因子水平(x±s)
组别 时间 TNF-α/(ng/mL) IL-4/(ng/L) IL-8/(ng/L) 对照组(n=128) 术前 1.76±0.32 52.95±9.18 193.05±20.41 术后3 d 1.25±0.22 44.65±6.80 131.50±17.24 观察组(n=150) 术前 1.80±0.37 53.15±9.24 193.28±20.34 术后3 d 0.70±0.13* 26.47±4.89* 104.30±14.65* TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; IL-4: 白细胞介素-4; IL-8: 白细胞介素-8。与对照组术后3 d比较, *P<0.05。
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表 4 2组应激指标(x±s)
组别 n MDA/(mol/L) SOD/(U/mL) GSH/(U/mL) 对照组 128 12.09±3.66 55.40±5.92 64.93±7.22 观察组 150 8.70±2.15* 71.34±8.46* 82.04±9.35* MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶; GSH: 谷胱甘肽。
与对照组比较, *P<0.05。
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表 5 2组通气功能指标(x±s)
组别 时间 AHI/h ODI/h LAT/s LSaO2/s 对照组(n=128) 术前 31.86±7.32 27.03±5.58 45.20±10.34 69.17±13.60 术后6个月 15.52±4.77 13.75±3.38 25.66±6.28 77.60±15.34 观察组(n=150) 术前 32.59±7.44 28.39±5.90 44.71±10.26 68.44±13.51 术后6个月 9.30±2.48* 8.10±1.17* 18.50±3.69* 85.49±17.80* AHI: 呼吸紊乱指数; ODI: 氧减指数; LAT: 最长呼吸暂停时间; LSaO2: 最低夜间血氧饱和度。
与对照组术后6个月比较, *P<0.05。
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表 6 2组PSQI评分(x±s)
分 组别 时间 睡眠质量 入睡时间 睡眠时间 睡眠效率 睡眠紊乱 安眠药物 日间功能 对照组(n=128) 术前 2.80±1.16 2.96±1.21 2.88±1.25 2.88±1.26 2.82±1.16 2.88±0.19 2.83±1.19 术后6个月 2.05±0.38# 2.17±0.49# 2.26±0.63# 2.31±0.70# 2.13±0.40# 2.40±0.53# 2.47±0.60# 观察组(n=150) 术前 2.76±1.13 2.90±1.18 2.83±1.20 2.95±1.31 2.70±1.12 2.80±1.16 2.86±1.22 术后6个月 1.02±0.10*# 1.06±0.11*# 1.12±0.17*# 1.20±0.22*# 0.98±0.07*# 1.15±0.20*# 1.07±0.13*# 与术前比较, *P<0.05; 与对照组比较, #P<0.05。
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表 7 2组并发症[n(%)]
组别 n 出血 呼吸道烧伤 软腭咽部功能不全 鼻咽部狭窄 发热 合计 对照组 128 3(2.34) 2(1.56) 2(1.56) 1(0.78) 8(6.25) 16(12.50) 观察组 150 3(2.00) 1(0.67) 1(0.67) 0 3(2.00) 8(5.33)* 与对照组比较, *P<0.05。
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