Quercetin inhibits invasion and promotes apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes by regulating miR-431-5p/mouse double minute 4 signaling pathway
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摘要:目的
探讨槲皮素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLSs)侵袭和凋亡的影响以及分子机制。
方法收集27例RA患者和25例非RA患者的滑膜组织。分析miR-431-5p和鼠双微基因4(MDM4) mRNA表达及其蛋白表达。将miR-431-5p抑制剂、miR-NC、MDM4过表达载体和pcDNA 3.1(+)载体转染至RA-FLSs, 转染后48 h, 在每孔中添加槲皮素，并收集细胞，测定细胞活力、细胞凋亡率和侵袭细胞数。采用双荧光素酶实验分析miR-431-5p和MDM4的结合关系。
结果miR-431-5p在RA滑膜组织和RA-FLSs中表达下调，在槲皮素诱导的RA-FLSs中上调，差异有统计学意义(P < 0.05)。miR-431-5p低表达或者MDM4过表达减弱了槲皮素对RA-FLSs凋亡的促进作用及对侵袭的抑制作用(P < 0.05)。miR-431-5p在RA-FLSs中结合MDM4, 且miR-431-5p通过MDM4调控RA-FLSs的凋亡和侵袭(P < 0.05)。
结论槲皮素通过介导miR-431-5p/MDM4信号通路来调控RA-FLSs侵袭和凋亡，提示槲皮素可能是治疗RA的替代药物。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of quercetin on invasion and apoptosis of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes (RA-FLSs) and its molecular mechanism.
MethodsSynovial tissues of 27 patients with RA and 25 patients without RA were collected. The mRNA expression and protein expression of miR-431-5p and mouse double minute 4 (MDM4) were analyzed. MiR-431-5p inhibitor, miR-NC, MDM4 overexpression vector and pcDNA 3.1 (+) vector were transfected into RA-FLSs. At 48 h after transfection, quercetin was added to each well, and cells were collected and cell viability, apoptosis rate and number of invasive cells were measured. Dual luciferase assay was used to analyze the binding relationship between miR-431-5p and MDM4.
ResultsThe expression of miR-431-5p was significantly down-regulated in RA synovial tissue and RA-FLSs, and significantly up-regulated in quercetin induced RA-FLSS (P < 0.05). The low expression of miR-431-5p or the overexpression of MDM4 weakened the promoting effect of quercetin on apoptosis of RA-FLSs and the inhibiting effect on invasion (P < 0.05). MiR-431-5p binded MDM4 in RA-FLSs, and miR-431-5p regulated apoptosis and invasion of RA-FLSs through MDM4 (P < 0.05).
ConclusionQuercetin regulates the invasion and apoptosis of RA-FLSS by mediating miR-431-5p/MDM4 signaling pathway, suggesting that quercetin may be an alternative drug for RA.
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Keywords:
- rheumatoid arthritis /
- quercetin /
- microRNA-431-5p /
- mouse double minute 4 /
- fibroblast-like synoviocytes /
- invasion /
- apoptosis
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骨盆骨折多由高能外伤所致。骨盆环分为前环及后环, 组成骨盆前环的坐骨支及耻骨支最易骨折。目前，手术治疗为骨盆前环骨折的首选治疗方式[1-2]。骨盆前环骨折固定方式分为手术内固定及外固定，其中改良Stoppa入路内固定为临床常用骨盆前环骨折内固定治疗入路方式，具有术野清晰、操作简单、术后神经损伤小等优点，外固定主要用于骨盆前环骨折临时固定，可有效控制出血情况[3-4]。近年来, 微创技术的不断发展使微创经骨膜外钢板内固定逐渐运用于骨盆前环骨折治疗中，且取得较好手术效果[5]。本研究回顾性分析改良Stoppa入路内固定与外固定及微创经骨膜外钢板内固定的治疗疗效，以期为骨盆前环骨折手术方式的选择提供理论依据，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2018年1月—2020年1月收治的98例骨盆前环骨折患者的临床资料，其中男60例，女38例，年龄17~95岁，平均(62.63±19.63)岁。纳入标准: ①有明确外伤史，经X线、CT等手段确诊的患者; ②年龄≥17岁者; ③受伤至手术时间≤14 d者; ④符合相应手术指征者; ⑤临床资料完整者; ⑥患者及其家属知情。排除标准: ①既往有骨盆骨折史者; ②合并严重心、肝、肾等器官功能障碍者; ③合并恶性肿瘤、免疫系统疾病、凝血功能障碍、全身感染等疾病者; ④对本研究手术有禁忌证者; ⑤临床资料不全者; ⑥妊娠期、哺乳期患者; ⑦合并精神障碍，无法配合研究者。根据治疗方式不同，分为A组、B组、C组。A组(33例)男20例，女13例; 年龄17~88岁，平均(63.28±19.31)岁; 体质量指数(BMI) (22.61±2.58) kg/m2; 受伤原因: 车祸伤28例, 高处坠落伤4例，严重挤压伤1例; Tile's分类: B型21例, C型12例; 平均受伤至手术时间(5.67±1.57) d。B组(31例)男19例，女12例; 年龄18~90岁，平均(63.37±19.32)岁; BMI(22.71±2.63) kg/m2; 受伤原因: 车祸伤26例，高处坠落伤3例，严重挤压伤2例; Tile's分类: B型20例, C型11例; 平均受伤至手术时间(5.71±1.66) d。C组(34例)男21例，女13例; 年龄20~95岁，平均(63.41±19.34)岁; BMI(22.80±2.71) kg/m2; 受伤原因: 车祸伤28例, 高处坠落伤4例，严重挤压伤2例; Tile's分类: B型22例, C型12例，平均受伤至手术时间(5.76±1.73) d。3组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 方法
术前准备: 所有患者入院后均先行病情评估，处理相应并发症，并完善相应影像学检查，待生命体征平稳后择期行手术治疗。
A组接受改良Stoppa入路内固定治疗。常规全身麻醉，嘱患者取仰卧位，于距耻骨联合上缘1.0~1.5cm处切1个8~10 cm的横形切口，逐层将皮下组织分离，并沿纵向将腹白线剖开，沿腹膜前间隙钝性分离达耻骨联合线，向两端将腹直肌牵开。若要扩大术野，则将患侧腹直肌切开，保留止点，沿耻骨支钝性分离，充分暴露耻骨联合和相应耻骨支，术中若出现“死亡冠”则行结扎处理。骨折复位满意则选取大小合适的钢板进行固定, X线透视下固定准确后逐层缝合。
B组患者接受外固定架治疗。根据患者实际情况进行局部麻醉或全身麻醉，嘱患者取仰卧位，以手法旋转/牵引复位骨折部位; 沿髂前上棘向下切开2.5~3.0 cm, 分离出缝匠肌并充分暴露髂前下棘，注意避免损伤股外侧皮神经。触及髂骨内外侧，保持钻头和躯干矢状面呈30~45 °角，沿髂后上棘钻入5~6 cm, 再拧入6 mm长尚氏钉。以相同方法钻入第2颗尚氏钉, 2个钉间隔1.0 cm, 对侧骨折处理方法相同。以钢针固定夹将两侧髂嵴钢针固定，并连接钢针固定架和2个纵向连接杆，注意保持横杆置于顶部，中段则需安置可自由伸缩横杆，待C形臂确认复位满意后拧紧总杆和横杆连接处，产生梯形固定。
C组患者接受微创经骨膜外钢板内固定术治疗。常规全身麻醉，嘱患者取仰卧位，于盆骨前环分别切耻骨结节为中心横形切口(2 cm, 显露至耻骨结节)及经髂前下棘斜形切口(2 cm, 显露至髂前下棘)，沿髂腰肌下间隙钝性分离达耻骨结节，注意避免损伤股外侧皮神经及男性精索/女性圆韧带。以卵圆钳沿髂前下棘切口置入，并走行于髂腰肌下，突破髂耻弓，使卵圆钳头部于耻骨结节切口暴露，隧道走行于重要血管、神经下。选取长度合适的钢板，预先弓形折弯，放置牵引带于钢板一端，以卵圆钳夹紧，使牵引钢板经过隧道，走行于筋膜肌肉下。钢板两端分别置于耻骨结节及髂前下棘处，若行耻骨联合内固定，则先于两侧耻骨结节切一切口，做皮下隧道并置入钢板，挤压骨盆将耻骨联合纠正分离，固定钢板, X线透视下固定准确后逐层缝合。
术后处理: 术中出血量较大者放置引流条，并于24 h后去除。术后24 h常规使用抗生素，术后第2天开始应用低分子肝素，术后1周于病床上开展被动功能锻炼，术后4~6周复查X线及CT, 骨折愈合良好则逐渐行不完全负重锻炼，术后8~12周逐渐开始完全负重下地行走(具体视患者恢复情况而定)。若无明显不适，无需取出内固定物。
1.3 观察指标
比较3组手术相关指标、术后骨折复位、临床疗效、并发症发生情况。手术相关指标包括切口长度、手术时间、术中出血量、骨折愈合时间。术后骨折复位采用Matta[6]标准进行评估: 根据术后12个月时入口位、出口位、前后位骨盆平片图像中骨折最大移位距离评估。复位满意: 最大移位距离≤4 mm; 复位良好: 最大移位距离>4~11 mm; 复位一般: 最大移位距离>11~21 mm, 复位较差: 最大移位距离>21mm。术后12个月采用Majeed标准[7]评估临床疗效: 从坐立、站立、疼痛、工作、性生活5个维度进行评估, 总分100分。优: ≥85分，良: 70~ < 85分，可: 55~ < 70分，差: < 55分，总有效率=(优+良)/总例数×100%。并发症包括术后感染、深静脉血栓、神经损伤、畸形愈合或不愈合等。
1.4 统计学方法
采用SPSS 22.0软件处理数据。其中，计数资料以[n(%)]表示, 3组比较行交叉表χ2检验，两两成对比较行连续校正χ2检验; 符合正态分布的计量资料以(x±s)表示, 3组比较行单因素方差分析, 两两成对比较行LSD-t检验; 等级资料行Kruskal-Wallis H检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 3组手术相关指标比较
C组切口长度大于B组和A组，且B组大于A组，差异有统计学意义(P < 0.05); B组手术时间、术中出血量优于C组和A组，且C组优于A组, C组骨折愈合时间短于A组和B组，且A组短于B组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 3组手术相关指标比较(x±s)组别 n 切口长度/cm 手术时间/min 术中出血量/mL 骨折愈合时间/月 A组 33 8.89±1.29* 50.69±6.53△ 62.46±12.40△ 4.02±0.31* B组 31 5.53±0.93*# 41.27±6.40 32.53±7.33 5.91±0.59*# C组 34 2.13±0.60 45.09±6.61△# 55.64±10.66△# 3.68±0.29 与C组比较, * P < 0.05; 与A组比较, #P < 0.05; 与B组比较, △P < 0.05。 2.2 3组术后骨折复位情况比较
A、C组患者骨折复位情况均优于B组，差异有统计学意义(P < 0.05), 但A、C组比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 2。
表 2 3组术后骨折复位情况比较[n(%)]组别 n 复位满意 复位良好 复位一般 复位较差 A组 33 24(72.73)* 9(27.27)* 0 0 B组 31 20(64.52) 10(32.26) 1(3.23) 0 C组 34 27(79.41)* 7(20.59)* 0 0 与B组比较, * P < 0.05。 2.3 3组临床疗效比较
3组临床治疗总有效率比较，差异有统计学意义(P < 0.05)。其中A、C组临床治疗总有效率均高于B组，差异有统计学意义(P < 0.05), 但A、C组比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 3。
表 3 3组临床疗效比较[n(%)]组别 n 优 良 可 差 总有效 A组 33 23(69.70) 9(27.27) 1(3.03) 0 32(96.97)* B组 31 23(74.19) 2(6.45) 6(19.35) 0 25(80.65) C组 34 24(70.59) 9(26.47) 1(2.94) 0 33(97.06)* 与B组比较, * P < 0.05。 2.4 3组术后并发症发生情况比较
3组术后并发症发生情况比较, 差异无统计学意义(P>0.05), 见表 4。
表 4 3组术后并发症发生情况比较[n(%)]组别 n 术后感染 深静脉血栓 神经损伤 畸形愈合
或不愈合合计 A组 33 1(3.03) 1(3.03) 0 0 2(6.06) B组 31 2(6.45) 1(3.23) 1(3.23) 0 4(12.90) C组 34 1(2.94) 0 0 0 1(2.94) 3. 讨论
骨盆为脊柱和主要负重结构连接的重要部位，同时也是保护、支撑内脏器官的基础，因此骨盆的稳定性极为重要[8]。骨盆前环骨折治疗目的为恢复骨盆环结构稳定性，若治疗不当会导致慢性疼痛、神经损伤、骨折畸形愈合等术后并发症，影响患者生活质量。因此，选择合适治疗方式对促进骨盆前环骨折愈合、提升患者生活质量尤为重要[9-10]。
外固定治疗适用于垂直方向稳定但旋转方向不稳定的骨盆前环骨折, 操作简便，可及时纠正骨盆骨折移位，控制出血量。但外固定治疗易发生术后感染，且存在复位效果不佳等情况，需行二次内固定手术复位[11]。切开复位内固定为目前治疗骨盆前环骨折较为理想方式，在X线透视下纠正骨折移位，可有效恢复骨盆解剖结构，并能够牢固固定，确保骨盆稳定性，从而有利于患者早期功能锻炼，降低术后并发症的发生风险[12]。改良Stoppa入路内固定术的应用降低了内固定术操作难度, 逐渐成为骨盆前环骨折首选内固定术式。该术式在腹膜外进行操作，术野清晰可准确显示方形区，且无需显露神经、股动脉组织，能够降低术后神经损伤风险，更利于钢板放置及骨折复位。但改良Stoppa入路内固定术存在损伤“死亡冠”而导致大出血的可能性，且手术操作受腹壁脂肪影响较大，而对于合并膀胱损伤患者则存在术后感染风险[13-14]。近年来，微创治疗技术逐渐发展，该术式操作简单、创伤低，术中一侧固定后能小范围撬拨复位骨折端，且与切开复位内固定不同，固定钢板置于深层组织下，患者术后若无明显不适，骨折愈合后无需取出钢板。但该术式对施术者要求较高，术中钢板预弯精度不够，且需要非直视下复位骨折，使得手术难度加大，应用并不广泛[15]。
本研究结果表明, 切口长度C组大于B组和A组，且B组大于A组，差异有统计学意义(P < 0.05); 手术时间、术中出血量B组优于C组和A组，且C组优于A组，骨折愈合时间C组短于A组和B组，且A组短于B组，差异有统计学意义(P < 0.05), 提示改良Stoppa入路内固定虽创伤较大，但骨折复位满意，疗效较好，外固定治疗虽手术时间短，术中出血量少，但骨折愈合时间长，复位效果及疗效均较差，而微创经骨膜外钢板内固定创伤小、骨折愈合时间短、复位效果及疗效与改良Stoppa入路内固定相当，与研究[16-17]结果一致。3组均未出现畸形愈合或不愈合情况，且术后并发症发生率均较低，提示3种治疗方法安全性均较好。
综上所述，改良Stoppa入路内固定与微创经骨膜外钢板内固定术治疗骨盆前环骨折较外固定治疗骨折愈合时间短，骨折复位及临床疗效更优，值得临床推广应用。
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图 1 miR-431-5p在滑膜组织、FLSs以及槲皮素诱导RA-FLSs中的表达
A: miR-431-5p在RA患者滑膜组织和正常滑膜组织中的表达分析，与对照比较, ***P < 0.001; B: miR-431-5p在FLSs中的表达分析，与对照比较, **P < 0.01; C: miR-431-5p在不同浓度槲皮素处理的RA-FLSs中的表达分析，与0 μmoL比较, *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。
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图 2 miR-431-5p和槲皮素对RA-FLSs凋亡和侵袭的影响
A: miR-431-5p表达分析; B: RA-FLSs活力分析; C: RA-FLS凋亡分析; D: 侵袭能力分析(放大倍数为100倍)。
两者比较, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。![]()
图 3 miR-431-5p在RA-FLSs中结合MDM4
A: miR-431-5p和MDM4结合位点; B: miR-431-5p和MDM4结合关系鉴定; C: MDM4 mRNA表达分析; D: miR-431-5p和MDM4表达相关性分析; E: MDM4蛋白表达检测。
与miR-NC比较, ****P < 0.000 1; 与对照比较, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。![]()
图 4 miR-431-5p和MDM4对RA-FLSs凋亡和侵袭的影响
A: MDM4蛋白表达分析; B: RA-FLSs细胞活力检测; C: RA-FLSs凋亡率检测; D: RA-FLSs侵袭数检测(放大倍数为100倍)。
两者比较, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。![]()
图 5 槲皮素和MDM4对RA-FLSs凋亡和侵袭的影响
A: MDM4蛋白表达分析; B: RA-FLSs细胞活力检测; C: RA-FLSs凋亡率检测; D: RA-FLSs侵袭数检测(放大倍数为100倍)。
两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。表 1 定量引物序列
基因 引物序列(5′-3′) MDM4 上游引物 GCCCTAGGATCTGTGACTGC 下游引物 AACATTTCACCTTGCGCACC miR-431-5p 上游引物 GTATGAGTGTCTTGCAGGCCGT 下游引物 CTCAACTGGTGTCGTGGAG GAPDH 上游引物 AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 下游引物 AGGGGCCATCCACAGTCTTC U6 上游引物 CTTCGGCAGCACATATACT 下游引物 AAAATATGGAACGCTTCACG 
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