Effect of recombinant human growth hormone on gut microbiota of short children based on 16S rDNA sequencing
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摘要:目的
通过16S rDNA高通量测序分析重组人生长激素(rhGH)治疗前后矮身材儿童肠道菌群的变化。
方法选取初次使用rhGH治疗的3~14岁矮身材儿童作为研究对象，按照rhGH使用剂型的不同分为长效组和短效组，每组16例。长效组使用聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)注射液，短效组使用短效rhGH注射液。分别留取2组患儿治疗前和治疗3、6个月时的新鲜粪便标本共83份，采用16S rDNA高通量测序技术结合生物信息分析技术比较2组患儿不同时点肠道菌群组成、丰度的差异及其与生长指标[胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、身高标准差积分(SDS)]的相关性。
结果治疗前及治疗3、6个月时, 2组Chao1指数、Pielou e指数依次升高，提示肠道菌群的丰富度、均匀度持续改善; 长效组治疗3个月时Chao1指数高于短效组，差异有统计学意义(P < 0.05)。置换多元方差分析(Per MANOVA)显示F=3.425、P=0.001, 非度量多维尺度(NMDS)分析显示Stress值为0.17, 提示rhGH可在一定程度上调节矮身材儿童肠道菌群组成和结构。随着rhGH使用时间的延长, 2组拟杆菌门、拟杆菌属的丰度和拟杆菌门与厚壁菌门比值(B/F)均逐渐上升，其余优势菌群的丰度呈现波动性变化，差异无统计学意义(P>0.05)。相关性分析显示，长效组治疗6个月时IGF-1、身高SDS均分别与拟杆菌门、拟杆菌属、B/F呈正相关，短效组治疗6个月时IGF-1与拟杆菌门、拟杆菌属、B/F均呈正相关，短效组治疗3个月时IGF-1、身高SDS与双歧杆菌属呈正相关。功能预测结果显示，肠道菌群主要参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢等途径。
结论rhGH能够改善矮身材儿童肠道菌群的组成和丰度，短期内PEG-rhGH在改善肠道菌群丰富度方面相较于短效rhGH具有一定优势, rhGH能增加有益菌丰度而发挥协同促生长作用。
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关键词:
- 16S rDNA测序 /
- 重组人生长激素 /
- 矮身材 /
- 儿童 /
- 肠道菌群 /
- 丰度 /
- 胰岛素样生长因子-1
Abstract:ObjectiveTo analyze the changes of gut microbiota of short children before and after recombinant human growth hormone (rhGH) treatment by 16S rDNA high-throughput sequencing.
MethodsShort children aged 3 to 14 years who were first treated with rhGH were selected as study objects, and were divided into long-acting group(n=16) and short-acting group (n=16) according to the dosage form of rhGH, and the long-acting group used polyethylen Glycol Recombinant Human Growth Hormone (PEG-rhGH). In the short-acting group, short-acting rhGH was used. A total of 83 fresh fecal specimens were collected from the two groups before treatment and 3 and 6 months after treatment, respectively. 16S rDNA high-throughput sequencing technology combined with bioinformation analysis technology were used to compare the differences in intestinal flora composition and abundance and explore their correlations with growth indicators[insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and height standard deviation score (SDS)]between the two groups at different time points.
ResultsThe Chao1 and Pielou e indexes gradually increased in two groups before treatment, 3 months and 6 months after treatment, indicating consistently improvement of the richness and homogeneity of the gut microbiota. Chao1 index of the long-acting group was higher than that of the short-acting group at 3 months (P < 0.05). Per MANOVA unweighted-unifrac result showed F value was 3.425 and P value was 0.001, and Non-metric Multidimensional Scale (NMDS) analysis showed that Stress value was 0.17, suggesting that rhGH can regulate intestinal flora composition and structure in short children to a certain extent. With the extension of the use time of rhGH, the abundance of Bacteroidota and Bacteroides increased gradually in both groups, and the ratio of Bacteroidota/Firmicutes (B/F) increased gradually, while the abundance of the rest of the flora showed fluctuating changes, but the differences were not statistically significant (P>0.05). Correlation analysis showed that IGF-1 and height SDS were positively correlated with Bacteroidetes, Bacteroidetes and B/F in the long-acting group at 6 months; IGF-1 was positively correlated with Bacteroidetes, Bacteroidetes and B/F in the short-acting group at 6 months; IGF-1 and height SDS were positively correlated with Bifidobacterium in the short-acting group at 3 months. The functional prediction analysis showed that the gut microbiota of each group was mainly involved in carbohydrate metabolism and amino acid metabolism.
ConclusionThe rhGH can improve the composition and abundance of gut microbiota in short children, and PEG-rhGH has an advantage in improving the abundance of gut microbiota in the short term compared with short-acting rhGH, and rhGH plays a synergistic role in growth promotion by increasing the abundance of beneficial bacteria.
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儿童矮身材是指在相似生活环境下，儿童个体身高低于同种族、同性别和同年龄人群平均身高2个标准差(-2.00 SD), 或低于第3百分位数(-1.88 SD)[1]。世界卫生组织公布的发展中国家矮小症发病率为32.5%[2], 中国的抽样调查结果[3]显示儿童矮小症的发病率约为3%，其中仅10%的矮小症患者得到治疗，严重影响患儿的身心健康。目前，重组人生长激素(rhGH)在临床中应用广泛，已成为治疗儿童矮身材的重要措施。肠道菌群是一个动态的微生物群体，其中厚壁菌及拟杆菌占90%以上，肠道菌群及其代谢产物对宿主的免疫系统、神经系统、内分泌及代谢等有重要的影响[4-5]。生长激素能够影响宿主肠道菌群的组成和丰度，肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)也可通过多种途径影响生长的相关机制，例如生长激素/胰岛素样生长因子-1轴、甲状腺素等[6], 但关于生长激素影响矮身材儿童肠道菌群的研究目前鲜有报道。近年来，高通量测序技术快速发展，这为研究肠道菌群与生长的关系及其潜在途径提供了可行性。本研究基于16S rDNA测序技术分析rhGH治疗前后矮身材儿童肠道菌群的组成及变化，探讨rhGH对肠道菌群的影响，以期为矮身材儿童的治疗提供新思路和新方案。
1. 对象与方法
1.1 研究对象
选取2021年7月—2022年4月就诊于江苏省苏北人民医院的3~14岁且初次使用rhGH治疗的矮身材儿童作为研究对象。收集患儿的临床资料，包括性别、年龄、身高标准差积分(SDS)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1), 并收集患儿的粪便样本。所有患儿及其监护人同意参与本研究并签署知情同意书，本研究经江苏省苏北人民医院医学伦理委员会审批(批文编号2021ky181)。纳入标准: ①年龄3~14岁者; ②需使用生长激素治疗的矮身材儿童[1](在正常生活水平下，身高低于同性别、同年龄、同种族儿童平均身高2个标准差，或低于第3百分位数); ③参与本研究前尚未使用生长激素治疗者。排除标准: ①每阶段样本收集前1个月内有益生菌、益生元或抗生素使用史和(或)有急性腹泻病史和(或)其他感染性疾病者; ②在收集样本的任意阶段有明显饮食结构改变者; ③合并严重先天性心脏病、消化道畸形、炎症性肠病、肝肾功能损害、代谢性疾病、血液系统肿瘤者; ④被研究者认为不适合参加本研究者。
1.2 治疗与分组方法
本研究最终纳入32例矮身材儿童，根据所用rhGH剂型的不同分为长效组和短效组，每组16例。长效组使用聚乙二醇重组人生长激素(PEG-rhGH)注射液(商品名金赛增，长春金赛药业有限责任公司，国药准字S20140001)皮下注射，剂量为每周0.2 mg/kg, 睡前0.5~1.0 h皮下注射，连续治疗6个月。短效组使用rhGH注射液(商品名赛增，长春金赛药业有限责任公司，国药准字S20050025), 剂量0.10~0.15 IU/(kg·d), 睡前0.5~1.0 h皮下注射，连续治疗6个月。治疗前1周内和治疗3、6个月时，分别留取2组患儿的粪便标本，检测并记录身高SDS和IGF-1水平。治疗过程中，部分患儿因病使用抗生素或益生菌，故未收集相应阶段的粪便标本及临床资料。长效组治疗前及治疗后3、6个月收集例数分别为16、12、10例，短效组治疗前及治疗后3、6个月收集例数分别为16、16、13例，共收集83份粪便样本。
1.3 16S rDNA测序方法
1.3.1 粪便样本收集及处理
分别留取入组患儿治疗前1周内和治疗3、6个月时的新鲜粪便样本约2 g, 置于无菌采集管或可室温保存的一次性大便样本采集处理器中，于2 h内送至医院并置于-80 ℃冰箱保存待测，运输时需用干冰低温保存。
1.3.2 16S rDNA高通量测序
将粪便样本送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行16S rDNA测序。全程按照试剂盒说明和操作规范进行操作。采用十六烷基三甲基溴化铵或十二烷基硫酸钠方法提取粪便基因组DNA, 通过引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGAC TACNNGGGTATCTAAT -3′)对细菌的16S rDNA V3~V4高变区序列进行聚合酶链反应(PCR)扩增、产物纯化和文库构建。通过NovaSeq 6000测序平台进行上机测序，对测序所得原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据。通过DADA2插件对有效数据进行降噪，并过滤掉丰度<5的序列，获得最终的扩增序列变体(ASVs)。
1.3.3 生物信息学分析
采用QIIME2软件的classify-sklearn算法对每个ASV使用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释。根据ASVs注释结果和各样品特征表，获得界、门、纲、目、科、属、种水平物种丰度表，比较各组肠道菌群的优势物种及其相对丰度。α多样性分析通过对各样本进行组间差异分析，可反映各组间微生物群落的丰富度、多样性和均匀度。β多样性分析通过分析坐标轴中样本间的距离直观地对不同样本的微生物群落构成进行比较，可评估样本间物种多样性。
1.4 统计学分析
采用SPSS 26.0统计学软件分析数据，计数资料组间比较采用χ2检验，符合正态分布的计量资料以(x ± s)表示，身高SDS、IGF-1、α多样性指数分析采用独立样本t检验和F检验, P<0.05为差异有统计学意义。组间肠道菌群种属差异分析采用Kruskal-Wallis检验，变量间相关性检验采用Pearson相关分析或Spearman相关分析，相关系数(r)绝对值>0.6为强相关, P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料比较
短效组男9例、女7例，平均年龄(9.16±2.56)岁; 长效组男10例、女6例，平均年龄(8.99±2.39)岁。2组患儿年龄(t=0.344, P=0.561)、性别(χ2=0.130, P=0.719)比较，差异均无统计学意义。短效组患儿不同时点间身高SDS、IGF-1比较，差异有统计学意义(F=17.863、34.853, P<0.001); 长效组患儿不同时点间身高SDS、IGF-1比较，差异有统计学意义(F=270.536、27.234, P<0.001)。2组患儿治疗3、6个月时的身高SDS、IGF-1均高于治疗前，且治疗6个月时的身高SDS、IGF-1均高于治疗3个月时，差异有统计学意义(P<0.05); 长效组治疗6个月时身高SDS高于短效组，治疗3个月时IGF-1低于短效组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表 1。
表 1 短效组和长效组患儿不同时点身高SDS、IGF-1水平比较(x ± s)组别 身高SDS IGF-1/(ng/mL) 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) -2.16±0.12 -1.78±0.12* -1.45±0.12*# 112.24±54.32 213.22±80.97* 352.74±85.60*# 长效组(n=16) -2.18±0.10 -1.84±0.11* -1.27±0.09*#△ 111.82±44.17 174.01±52.76*△ 331.55±121.87*# 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。SDS: 标准差积分; IGF-1: 胰岛素样生长因子-1。与治疗前比较, *P<0.05; 与治疗3个月时比较, #P<0.05; 与短效组比较, △P<0.05。 2.2 样本数据分析
2.2.1 α多样性指数组间差异性分析
Chao1指数反映物种丰富度，数值越大表示物种丰富度越高; Shannon指数反映群落多样性，数值越大表示群落多样性越高; Pielou e指数反映群落均匀度，数值越大表示物种越均匀。治疗前及治疗3、6个月时，长效组Chao1指数、Shannon指数、Pielou e指数均逐渐升高，但不同时点间差异无统计学意义(F=0.308、0.982、0.818, P=0.737、0.385、0.450); 治疗前及治疗3、6个月时，短效组Chao1指数、Pielou e指数均逐渐升高, Shannon指数先升高再降低，但不同时点间差异均无统计学意义(F=0.663、0.761、0.930，P=0.520、0.473、0.403)。长效组治疗3个月时Chao1指数高于短效组，差异有统计学意义(P<0.05); 长效组其他时点Chao1指数和各时点Shannon指数、Pielou e指数与短效组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。随着rhGH使用时间的延长，患儿肠道菌群的丰富度、多样性、均匀度得到改善; PEG-rhGH在改善肠道菌群丰富度、多样性、均匀度方面相较于短效rhGH更具持续性和稳定性, PEG-rhGH短期内(治疗3个月)在改善肠道菌群丰富度方面显著优于短效rhGH。见表 2、表 3、表 4。
表 2 短效组和长效组不同时点Chao1指数、Shannon指数比较(x ± s)组别 Chao1指数 Shannon指数 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) 253.18±71.87 275.44±55.13 280.07±79.05 5.51±0.47 5.74±0.70 5.62±0.68 长效组(n=16) 310.29±92.48 324.09±82.36* 337.89±87.08 5.85±0.50 5.95±0.42 6.11±0.45 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。与短效组比较, *P<0.05。 表 3 短效组和长效组不同时点Pielou e指数比较(x ± s)组别 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) 0.69±0.05 0.70±0.06 0.71±0.04 长效组(n=16) 0.71±0.04 0.72±0.04 0.73±0.03 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。 表 4 不同时点样本的α多样性指数比较(x ± s)时点 样本数 Chao1指数 Shannon指数 Pielou e指数 治疗前 32 292.86±77.00 5.68±0.51 0.70±0.05 治疗3个月 28 283.57±83.12 5.83±0.60 0.71±0.50 治疗6个月 23 305.21±85.85 5.92±0.49 0.72±0.04 各时点样本数为短效组与长效组的合计样本数。 2.2.2 β多样性分析
β多样性分析是对不同样本的微生物群落构成进行比较分析，通过分析坐标轴中样本和样本之间的距离直观观察各组样本的菌群差异性，若各组样本间的直线距离较近，表示各组间菌群差异较小，反之表示差异较大。置换多元方差分析(Per MANOVA)unweighted-Unifrac结果显示, F=3.425, P=0.001, 表明组间肠道菌群组成存在显著差异; 非度量多维尺度(NMDS)分析是将样本中包含的物种信息以点的形式反映在多维空间上，不同样本间的差异程度通过点与点之间的距离体现，可反映样本组间和组内差异，见图 1。图中每个点表示1个样本，点与点之间的距离表示差异程度，同组同时点样本使用同一种颜色表示，其中Stress值为0.17(<0.20)具有一定解释意义，可反映各样本间菌群结构的差异程度。Per MANOVA结合NMDS分析结果表明, rhGH可在一定程度上调节矮身材儿童肠道菌群组成和结构。
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图 1 NMDS分析结果S0: 短效组治疗前样本; S3: 短效组治疗3个月时样本; S6: 短效组治疗6个月时样本; L0: 长效组治疗前样本; L3: 长效组治疗3个月时样本; L6: 长效组治疗6个月时样本。2.2.3 肠道菌群物种组成
基于QIIME2软件分别在门水平和属水平选取前4位的优势物种并列出相关丰度占比，见表 5、表 6。在门水平上, 2组不同时点样本均以厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门为主(占95%以上); 在属水平上, 2组不同时点样本均以布劳特氏菌属、双歧杆菌属、粪杆菌属和拟杆菌属为主。随着rhGH使用时间的延长，拟杆菌门、拟杆菌属的丰度和拟杆菌门与厚壁菌门比值(B/F)逐渐上升; 长效组治疗6个月时放线菌门丰度低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05); 治疗6个月时，长效组双歧杆菌丰度分别低于治疗3个月时和短效组，差异有统计学意义(P<0.05)。随着rhGH使用时间的延长，患儿肠道菌群的物种丰度虽然受到影响，但优势菌群的种类未发生改变。
表 5 门水平优势菌群的丰度占比和B/F比较组别 时点 样本数 厚壁菌门/% 拟杆菌门/% 放线菌门/% 变形菌门/% B/F 长效组 治疗前 16 70.76 10.63 11.57 6.45 0.15 治疗3个月 12 62.60 14.88 14.04 4.20 0.24 治疗6个月 10 66.87 18.60 8.31* 4.95 0.28 短效组 治疗前 16 68.95 10.41 15.96 2.19 0.15 治疗3个月 16 64.18 14.45 15.46 4.80 0.23 治疗6个月 13 66.23 16.27 12.96 3.95 0.25 B/F: 拟杆菌门与厚壁菌门比值。与治疗3个月时比较, *P<0.05。 表 6 属水平优势菌群的丰度占比% 组别 时点 样本数 布劳特氏菌属 双歧杆菌属 粪杆菌属 拟杆菌属 长效组 治疗前 16 17.15 8.31 13.34 7.95 治疗3个月 12 13.88 10.84 10.41 9.55 治疗6个月 10 16.29 5.40*# 9.93 13.83 短效组 治疗前 16 15.49 13.31 8.73 8.51 治疗3个月 16 15.76 13.43 12.21 11.50 治疗6个月 13 16.67 11.89 12.93 11.79 与治疗3个月时比较, *P<0.05; 与短效组比较, #P<0.05。 2.2.4 功能预测
PICRUSt2功能预测结果显示，排名前10位的信号通路分别为卡尔文循环(CBB)、糖原降解Ⅰ、糖原生物合成Ⅰ(来自ADP-D-葡萄糖)、L-异亮氨酸生物合成Ⅰ(来自苏氨酸)、磷酸戊糖途径(非氧化分支)、L-异亮氨酸生物合成Ⅱ、蔗糖降解Ⅲ(蔗糖转化酶)、淀粉降解Ⅴ、丙酮酸发酵制异丁醇、L-缬氨酸生物合成，表明肠道菌群主要参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢等途径。
2.2.5 优势菌群与IGF-1、身高SDS的相关性分析
根据ASVs注释结果和各样本特征表，获得各样本在门水平和属水平的优势物种及其相对丰度，并与对应的IGF-1、身高SDS进行Pearson相关分析或Spearman相关分析。在门水平上，长效组治疗6个月时IGF-1与拟杆菌门(r=0.706, P=0.022)、B/F(r=0.794, P=0.006)呈正相关，身高SDS与拟杆菌门(r=0.632, P=0.048)、B/F(r=0.626, P=0.047)呈正相关; 短效组治疗6个月时IGF-1与拟杆菌门(r=0.637, P=0.019)、B/F(r=0.736, P=0.004)呈正相关，与厚壁菌门(r=-0.581, P=0.037)呈负相关。在属水平上，长效组治疗6个月时拟杆菌属与IGF-1(r=0.640, P=0.046)、身高SDS(r=0.675, P=0.032)呈正相关; 短效组治疗6个月时IGF-1与拟杆菌属(r=0.577, P=0.039)呈正相关; 短效组治疗3个月时双歧杆菌属与IGF-1(r=0.562, P=0.024)、身高SDS(r=0.556, P=0.049)呈正相关。rhGH应用于矮身材儿童能实现促生长作用并提高体内IGF-1水平，且2组患儿部分时点的肠道优势菌群与IGF-1、身高SDS呈正相关，提示rhGH与肠道菌群可能具有协同促生长作用。
3. 讨论
2000年世界卫生组织通过了一项关于孕产妇、婴幼儿营养问题的决议并商定了全球目标，其中主要目标是到2025年将5岁以下发育不良儿童的数量减少40%, 但按照目前的进展速度, 2025年仍会有1.27亿名发育不良儿童，数量仅减少26%[2]。中国目前仍有很多矮身材儿童未得到治疗，而rhGH治疗是一个长期、动态的过程，疗程应视患儿具体情况决定，一般治疗时间不宜短于1年[1]。动物试验[7]证实，生长激素对肠道菌群存在一定影响，例如在生长激素基因中断(GH-/-)小鼠和生长激素长期增加的牛生长激素转基因(bGH)小鼠的模型中, 6月龄的GH-/-小鼠和bGH小鼠的微生物图谱与同窝对照小鼠相比均发生改变。本研究对使用不同剂型rhGH的矮身材儿童不同时期肠道菌群进行测序发现，随着rhGH使用时间的延长，患儿肠道菌群的丰富度、多样性、均匀度和结构组成改善，且相较于短效的rhGH, PEG-rhGH在改善患儿肠道菌群丰富度、多样性和均匀度方面更具有稳定性，短期内改善肠道菌群丰富度的优势更明显。
肠道菌群数量繁多且组成复杂，了解发挥主要作用的菌群至关重要。本研究结果显示, 2组患儿不同时点的门水平优势菌群均为厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门，属水平优势菌群均为布劳特氏菌属、双歧杆菌属、拟杆菌属和粪杆菌属。厚壁菌门和拟杆菌门可以产生糖苷水解酶，促进食物发酵和分解，将其转化成SCFAs, 从而促进能量吸收[8]。变形菌门是具有潜在致病性的常见菌，能促进炎症反应[9]。放线菌门可在人类、动物和植物中引发各种感染，其中最主要的致病放线菌是结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌[10]。拟杆菌属作为人体肠道重要的益生菌，可促进碳水化合物发酵产生乙酸和丙酸，参与多糖和胆固醇代谢，影响体内葡萄糖和脂质稳态及能量代谢，为人体提供营养并维持肠道功能。本研究发现，长效组和短效组治疗过程中拟杆菌门、拟杆菌属丰度及B/F均逐渐上升，并与IGF-1、身高SDS呈正相关，其余菌门和菌属丰度呈波动性变化，治疗6个月时2组厚壁菌门、放线菌门的丰度和长效组变形菌门的丰度均较治疗前降低。由此提示，持续使用rhGH一方面能够提高对人体有益的拟杆菌的丰度及B/F，另一方面能够降低有害菌的丰度。研究[6]表明，肠道微生物对生长激素的代谢途径(或影响)不同等，是肠道菌群中有益菌群和致病菌群丰度变化不同的原因，进一步证实生长激素与肠道菌群之间存在相互作用。
肠道菌群可以调节宿主的生长，例如嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和部分大肠杆菌已被证实可以促进生长[6]。肠道菌群及其主要代谢产物SCFAs可通过影响生长激素、IGF-1、甲状腺激素、性激素[6, 11-12]等多种途径影响宿主的生长发育。研究[6]指出，肠道菌群的定植可通过SCFAs增加血清IGF-1表达。SCFAs大部分由肠道菌群分解碳水化合物产生，少部分来自肠道菌群对蛋白质和氨基酸的分解代谢，且厚壁菌门和拟杆菌门是产生SCFAs的优势菌[13]。本研究中，功能预测结果显示肠道菌群主要参与碳水化合物和氨基酸代谢等途径，相关分析结果显示拟杆菌属、B/F、双歧杆菌属与IGF-1和(或)身高SDS具有相关性，提示肠道菌群促生长的潜在途径可能与SCFAs相关。
综上所述, rhGH能够改善矮身材儿童肠道菌群的丰富度、多样性和均匀度，提高肠道内部分有益菌的丰度，并降低有害菌的丰度，且短期内PEG-rhGH在改善肠道菌群丰富度方面相较于短效rhGH具有一定优势。大量动物实验已证实肠道菌群与生长激素存在相互作用，本研究亦证实外源性rhGH对肠道菌群具有调节作用，但肠道菌群对人体生长激素的影响及相关途径还需进一步研究。本研究纳入样本数量较小，后续研究还应扩大样本量、延长样本收集周期及完善代谢组学检测，以探寻与生长相关的特定菌群或介质，通过补充益生菌或粪菌移植等方式实现协同rhGH促生长的目标，在为临床诊治提供新方案的同时减轻矮身材儿童家庭和社会的压力。
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图 1 NMDS分析结果
S0: 短效组治疗前样本; S3: 短效组治疗3个月时样本; S6: 短效组治疗6个月时样本; L0: 长效组治疗前样本; L3: 长效组治疗3个月时样本; L6: 长效组治疗6个月时样本。
表 1 短效组和长效组患儿不同时点身高SDS、IGF-1水平比较(x ± s)
组别 身高SDS IGF-1/(ng/mL) 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) -2.16±0.12 -1.78±0.12* -1.45±0.12*# 112.24±54.32 213.22±80.97* 352.74±85.60*# 长效组(n=16) -2.18±0.10 -1.84±0.11* -1.27±0.09*#△ 111.82±44.17 174.01±52.76*△ 331.55±121.87*# 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。SDS: 标准差积分; IGF-1: 胰岛素样生长因子-1。与治疗前比较, *P<0.05; 与治疗3个月时比较, #P<0.05; 与短效组比较, △P<0.05。 
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表 2 短效组和长效组不同时点Chao1指数、Shannon指数比较(x ± s)
组别 Chao1指数 Shannon指数 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) 253.18±71.87 275.44±55.13 280.07±79.05 5.51±0.47 5.74±0.70 5.62±0.68 长效组(n=16) 310.29±92.48 324.09±82.36* 337.89±87.08 5.85±0.50 5.95±0.42 6.11±0.45 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。与短效组比较, *P<0.05。
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表 3 短效组和长效组不同时点Pielou e指数比较(x ± s)
组别 治疗前 治疗3个月 治疗6个月 短效组(n=16) 0.69±0.05 0.70±0.06 0.71±0.04 长效组(n=16) 0.71±0.04 0.72±0.04 0.73±0.03 治疗前和治疗3、6个月时，短效组例数分别为16、16、13例，长效组分别为16、12、10例。
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表 4 不同时点样本的α多样性指数比较(x ± s)
时点 样本数 Chao1指数 Shannon指数 Pielou e指数 治疗前 32 292.86±77.00 5.68±0.51 0.70±0.05 治疗3个月 28 283.57±83.12 5.83±0.60 0.71±0.50 治疗6个月 23 305.21±85.85 5.92±0.49 0.72±0.04 各时点样本数为短效组与长效组的合计样本数。
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表 5 门水平优势菌群的丰度占比和B/F比较
组别 时点 样本数 厚壁菌门/% 拟杆菌门/% 放线菌门/% 变形菌门/% B/F 长效组 治疗前 16 70.76 10.63 11.57 6.45 0.15 治疗3个月 12 62.60 14.88 14.04 4.20 0.24 治疗6个月 10 66.87 18.60 8.31* 4.95 0.28 短效组 治疗前 16 68.95 10.41 15.96 2.19 0.15 治疗3个月 16 64.18 14.45 15.46 4.80 0.23 治疗6个月 13 66.23 16.27 12.96 3.95 0.25 B/F: 拟杆菌门与厚壁菌门比值。与治疗3个月时比较, *P<0.05。
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表 6 属水平优势菌群的丰度占比
% 组别 时点 样本数 布劳特氏菌属 双歧杆菌属 粪杆菌属 拟杆菌属 长效组 治疗前 16 17.15 8.31 13.34 7.95 治疗3个月 12 13.88 10.84 10.41 9.55 治疗6个月 10 16.29 5.40*# 9.93 13.83 短效组 治疗前 16 15.49 13.31 8.73 8.51 治疗3个月 16 15.76 13.43 12.21 11.50 治疗6个月 13 16.67 11.89 12.93 11.79 与治疗3个月时比较, *P<0.05; 与短效组比较, #P<0.05。
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