Glycosylation of MUC2 on the invasions and metabolic functions of Escherichia and its involvement in the pathogenesis of ulcerative colitis
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摘要:目的
探讨黏蛋白MUC2的糖基单一化对Escherichia侵袭力及代谢功能的影响及其参与溃疡性结肠炎发病的机制。
方法选取溃疡性结肠炎(UC)75例患者纳入研究组，同期选取健康体检者75例纳入对照组。免疫组化检测正常黏膜组织及UC组织中MUC2蛋白水平，采用酶联免疫试剂盒(ELISA)检测C反应蛋白酶(CRP)、粪便钙卫蛋白(FC)水平，全自动生化分析仪检测降钙素原(PCT)水平。Escherichia处理HT29细胞后，分为A组(细胞+MUC2的多聚糖)、B组(细胞+单糖)、C组(细胞+磷酸盐缓冲液)。观察Escherichia生物膜，检测Escherichia黏附力及侵袭能力。聚合酶链反应(PCR)检测LasR、pvdA、pcrV及GUS水平。
结果正常黏膜组织及UC组织中MUC2蛋白表达水平比较，差异有统计学意义(t=13.770, P < 0.001)。轻度UC患者组织MUC2蛋白水平为(0.63±0.10), 中度UC患者为(0.55±0.09), 重度UC患者为(0.50±0.05), 差异有统计学意义(F=14.880, P < 0.001)。与对照组相比，研究组患者CRP、FC、PCT水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.05);与轻度相比，中度患者CRP、FC、PCT水平升高，与中度患者相比，重度患者CRP、FC、PCT水平升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。在UC中, MUC2与CRP、FC、PCT水平均呈负相关。A组、B组、C组Escherichia黏附率分别为(15.30±2.55)%、(63.25±8.08)%及(48.61±6.67)%, 差异有统计学意义(F=93.480, P < 0.001)。A组、B组、C组Escherichia侵袭率分别为(24.80±5.11)%、(70.21±10.60)%及(53.34±8.06)%, 差异有统计学意义(F=46.620, P < 0.001)。与A组相比, B组LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平升高，与B组相比, C组LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论UC中MUC2表达降低，并随疾病程度的加重而降低，其与CRP、FC、PCT表达呈负相关。Escherichia与MUC2的糖基单一化培养后，可增加其侵袭及黏附能力，以及提高其毒性作用。
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of glycosylation of MUC2 on the invasions and metabolic functions of Escherichia and its involvement in the pathogenesis of ulcerative colitis.
MethodsA total of 75 patients with ulcerative colitis (UC) were included in the study group, and 75 healthy subjects were included in control group. Immunohistochemistry was used to detect MUC2 protein levels in normal mucosal tissues and UC tissues. C-reactive protease (CRP) and fecal calprotectin (FC) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and procalcitonin (PCT) was detected by automatic biochemical analyzer. HT29 cells were treated with Escherichia, and then divided into group A (cell+MUC2 polysaccharide), group B (cell+monosaccharide) and group C (cell+phosphate buffer). Escherichia biofilm was observed, and the adhesion and invasion ability of Escherichia were detected by AGAR plate. LasR, pvdA, pcrV and GUS levels were detected by polymerase chain reaction (PCR).
ResultsThe expression level of MUC2 protein in normal mucosa tissues and UC tissues was statistically significant (t=13.770, P < 0.001). The MUC2 protein level was (0.63±0.10) in patients with mild UC, (0.55±0.09) in patients with moderate UC, and (0.50±0.05) in patients with severe UC, and the difference was statistically significant (F=14.880, P < 0.001). Compared with the control group, the levels of CRP, FC and PCT in the study group were statistically increased (P < 0.05). Compared with mild patients, the levels of CRP, FC and PCT in moderate patients were significantly increased, while those in severe patients were significantly increased (P < 0.05); in UC disease, MUC2 was negatively correlated with CRP, FC, and PCT levels. The adhesion rates of Escherichia in group A, group B and group C were (15.30±2.55)%, (63.25±8.08)% and (48.61±6.67)%, respectively (F=93.480, P < 0.001). The invasion rates of Escherichia in groups A, B, and C were (24.80±5.11)%, (70.21±10.60)% and (53.34±8.06)%, respectively, and the differences were statistically significant (F=46.620, P < 0.001). Compared with group A, the levels of LasR, pvdA, pcrV and GUS genes in group B were significantly increased, and the levels of LasR, pvdA, pcrV and GUS genes in group C were significantly decreased compared with group B (P < 0.05).
ConclusionThe expression of MUC2 in UC is decreased and decreased with the severity of the disease, which is negatively correlated with the expression of CRP, FC and PCT. The monosaccharide culture of Escherichia and MUC2 can increase its invasion and adhesion ability, and enhance its toxicity.
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Keywords:
- ulcerative colitis /
- mucin /
- Escherichia /
- virulence gene /
- invasion /
- adhesion
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肾结石是泌尿外科的常见病和多发病。直径大于2 cm的肾结石的治疗策略主要是体外冲击波碎石、经皮肾镜碎石取石术和逆行肾内输尿管软镜碎石术(RIRS)[1-2]。体外冲击波碎石疗效不确切，经皮肾镜碎石取石术的清石率较高，但手术风险也较高。RIRS治疗肾结石的创伤小、手术风险低，但清石率相对较低[3]。目前, RIRS联合可弯曲负压吸引鞘在临床上有广泛应用[4]。本研究观察输尿管软镜联合可弯曲负压吸引鞘治疗肾结石的疗效，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2020年1月—2022年8月本院肾结石患者59例，根据手术方式的不同分为RIRS组和联合组。RIRS组28例，女10例，男18例，年龄25~67岁，平均(49.25±13.28)岁。联合组31例，女16例，男15例，年龄21~70岁，平均(50.39±13.73)岁。2组患者性别和年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本院医学伦理委员会批准本研究，手术前患者或家属签署知情同意书。纳入标准: 影像学检查确诊肾结石者; 肾结石直径2~3 cm者; 符合手术指征者。排除标准: ①合并重要脏器器质性病变者; ②肾结核患者; ③凝血功能异常者; ④脊柱畸形或不能耐受插管全身麻醉患者; ⑤结石>3 cm或 < 2 cm者。
1.2 治疗方法
RIRS组患者行插管全身麻醉，入室后取截石位，进行常规消毒和铺单。采用输尿管镜进入膀胱，置入异物钳，将预置双J管拔除; 再次进镜，置入超滑导丝，并在导丝引导下进入输尿管开口，继续上行至肾盂; 退出输尿管镜，保留超滑导丝，并在导丝引导下置入输尿管软镜鞘; 软镜通过输尿管软镜鞘进入肾盂，检查肾盂肾盏，找到结石后，插入钬激光光纤，将结石粉碎; 通过取石网篮将较大的结石碎片取出后，留置双J管1根。术后第1天和第4周，拍摄腹部平片检查结石残留情况。
联合组患者行插管全身麻醉，入室后取截石位，进行常规消毒和铺单。采用输尿管镜进入膀胱，置入异物钳，将预置双J管拔除; 再次进镜，置入超滑导丝，并在导丝引导下进入输尿管开口，继续上行至肾盂; 退出输尿管镜，保留超滑导丝，并在导丝引导下置入可弯曲负压吸引鞘; 将负压吸引器连接至负压吸引鞘，压力设置为150~200 mmHg, 同时使用连续性压力泵进行灌注，流速设置为150~200 mL/min; 软镜引入，检查肾盂肾盏，找到结石后，插入钬激光光纤，将结石粉碎; 结石碎片通过负压吸引鞘吸出后，留置双J管1根。术后第1天和第4周，拍摄腹部平片检查结石残留情况。
1.3 评价标准
① 比较2组患者的结石清除率，以无结石残留或碎石末≤3 mm为清石成功。②比较2组患者手术时间、术中失血量和术后住院时间。术中失血量通过碱羟高铁血红素(AHD-575)法计算。③比较2组患者术后血尿持续时间和术后感染发生率。
1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析。计量资料以(x±s)表示，组间数据比较行t检验。计数资料以例数(n)和百分比(%)表示，组间数据比较行χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患者一般资料比较
2组患者结石大小、并发症发生情况、尿路感染情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
表 1 2组患者一般资料比较(x±s)组别 结石大小/mm 并发症 尿路感染 无 伴肾积水 伴肾功能损害 无 有 RIRS组(n=28) 24.53±2.58 6 18 4 22 6 联合组(n=31) 24.09±2.71 7 20 4 27 4 2.2 2组患者手术情况比较
RIRS组手术时间、术中失血量大于联合组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 2组患者手术情况比较(x±s)组别 手术时间/min 术中失血量/mL 术后住院时间/d RIRS组(n=28) 72.50±11.38 54.10±2.59 4.21±0.83 联合组(n=31) 56.84±9.65* 40.94±8.73* 4.16±0.73 与RIRS组比较, *P < 0.05。 2.3 2组患者结石清除率比较
联合组即刻清石率、术后4周清石率分别为77.42%(24/31)、96.77%(30/31)，高于RIRS组的7.14%(2/28)、71.42%(20/28)，差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.4 2组患者术后并发症比较
RIRS组和联合组均无术后大出血，但联合组术后血尿持续时间更短，术后感染发生率更低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 2组术后血尿持续时间及感染率比较(x±s)[n(%)]组别 术后血尿持续时间/d 术后感染 RIRS组(n=28) 10.03±3.05 5(17.86) 联合组(n=31) 6.06±1.86* 1(3.23)* 与对照组比较, *P < 0.05。 3. 讨论
在中国，上尿路结石的发病率显著高于下尿路结石，而肾结石的发病率为4%~10%, 其中南方地区的发病率则高达13%[5]。临床上对于直径 < 2 cm的肾结石，大多数医师会选择RIRS。RIRS是通过人体自然腔道进行碎石手术，因此整个手术过程更加接近无创要求[6]。对于直径≥2 cm的肾结石, RIRS的清石率不高，临床开展受到一定的限制[7]。
RIRS手术过程中，肾盂肾盏的黏膜受损，毛细血管破损，血液进入灌注液，从而引起视野模糊。血凝块也会掩盖较大的结石碎块，导致结石残余的可能性增加。此外，碎石过程中产生的碎石末会导致“暴风雪”现象，造成碎石困难[8]。可弯曲负压吸引鞘可以将肾盂肾盏内的血液及时吸除，避免形成血块。同时，结石碎末在负压的作用下，可以快速被吸出，既增加术野的清晰度，保证碎石的效率，又减少了取石时间，降低残石的发生率。本研究中，联合组即刻清石率为77.42%, 显著高于RIRS组的7.14%; 术后4周清石率方面, RIRS组为71.42%, 显著低于联合组的96.77%; RIRS组手术时间、术中失血量显著大于联合组。
普通的RIRS手术在碎石过程中，由于其相对封闭的环境，会引起肾盂灌注压的增加，这样必然会促进包裹在感染性肾结石内的细菌释放到灌注液中，进入血液而导致感染。如果感染不能及时被控制，则有发生尿源性脓毒血症，甚至感染性休克的风险[9]。研究[10-11]显示, RIRS术后感染发生率与肾盂内灌注压呈正相关，灌注压越大，细菌及其内毒素被人体吸收的可能性也就越高。因此，降低肾盂灌注压可以降低感染的发生率。RIRS联合可弯曲负压吸引鞘可以较好地解决这个问题。可弯曲负压吸引鞘在配合灌注下可保持肾内低压，负压环境下降低尿源性菌血症发生率。本研究显示, RIRS组感染的发生率为17.86%, 而联合组的感染发生率仅为3.23%, 因此RIRS联合可弯曲负压吸引鞘为治疗感染性肾结石提供了一种新的策略。
钬激光是一种波长为2 140 nm的高能脉冲式激光，其脉冲持续时间为0.25 ms。钬激光的瞬时功率可以达到10~20 kW, 在泌尿外科中广泛用于粉碎多种成分的结石。在RIRS碎石过程中，由于肾盂相对封闭的环境和较长的手术时间，会升高肾盂肾盏内灌注液的温度，造成肾盂肾盏尿路上皮的热损伤。研究[12]显示，肾的热损伤风险与肾盂灌注压和灌注液流速呈反比。因此，降低肾盂灌注压或者提高灌注液流速均可以降低肾的热损伤风险。在RIRS过程中，使用可弯曲负压吸引鞘可以降低肾盂灌注压; 同时，由于连接中心负压或负压吸引器(150~200 mmHg), 并且使用连续性压力泵进行灌注(150~200 mL/min), 联合组的灌注流速较高，可以带走钬激光碎石过程中产生的热量，从而降低RIRS对肾的热损伤。本研究中，联合组在治疗2~3 cm肾结石患者时，需要较少的手术时间，并且即刻清石率和术后4周清石率更高，结石排出更彻底。同时，联合组术后血尿持续时间更短，感染率更低。
综上所述，在处理直径2~3 cm的肾结石时，RIRS联合可弯曲负压吸引鞘的清石率更高，手术时间更短，术后并发症更少，感染发生率更低。
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表 1 对照组及研究组患者CRP、FC、PCT水平比较(x±s)
组别 CRP/(μg/mL) FC/(μg/g) PCT/(μg/L) 对照组(n=75) 1.22±0.67 128.52±13.62 0.12±0.03 研究组(n=75) 5.68±2.35* 285.25±22.36* 0.31±0.08* CRP: C反应蛋白; FC: 粪便钙卫蛋白; PCT: 降钙素原。
与对照组比较, *P < 0.05。
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表 2 不同疾病程度UC患者的CRP、FC、PCT水平比较(x±s)
组别 CRP/(μg/mL) FC/(μg/g) PCT/(μg/L) 轻度(n=27) 4.76±1.86 260.63±20.37 0.26±0.05 中度(n=26) 5.60±2.38* 289.90±21.18* 0.32±0.07* 重度(n=22) 6.68±2.71*# 305.22±25.53*# 0.35±0.12*# CRP: C反应蛋白; FC: 粪便钙卫蛋白; PCT: 降钙素原。
与轻度患者比较, *P < 0.05; 与中度患者比较, #P < 0.05。
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表 3 各组Escherichia中LasR、pvdA、pcrV及GUS基因水平比较(x±s)
组别 LasR pvdA pcrV GUS A组 1.02±0.15 0.96±0.20 0.68±0.10 0.67±0.10 B组 1.65±0.22* 1.35±0.24* 0.96±0.17* 0.90±0.14* C组 1.30±0.30*# 1.12±0.19*# 0.73±0.11*# 0.82±0.12*# 与A组比较, *P < 0.05; 与B组比较, #P < 0.05。
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