Influences of indwelling time of venous indwelling needle on inflammatory factors, oxidative stress indexes and coagulation factors in the ear vein of white rabbits
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摘要:目的
探讨静脉留置针的不同留置时间对白兔耳缘静脉中炎症因子、氧化应激指标及凝血因子的影响。
方法将40只新西兰白兔随机分为对照组、留置4 d组、留置6 d组和留置8 d组, 每组10只。留置组用静脉留置针刺破白兔的耳静脉。留置后第4、6和8天取血和耳静脉标本，检测血常规。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测耳静脉血管组织白细胞介素(IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及血清血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)、内皮素1(ET-1)水平。采用生化法检测耳静脉血管组织丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。苏木精-伊红(HE)染色观察兔耳静脉血管组织病理学变化。
结果与另外3组相比，留置8 d组白细胞(WBC)、血小板(PLT)、中性粒细胞百分比(Gran)、IL-1、IL-6、TNF-α、MDA、TXB2、ET-1水平及血管炎症反应程度和血栓发生率升高, SOD、GSH-Px活性、6-keto-PGF1a水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论静脉留置针留置时间超过6 d后，耳静脉中炎症因子增多，并可诱导氧化应激，促进静脉炎和血栓形成。
Abstract:ObjectiveTo investigate the influences of different indwelling time of venous indwelling needle on inflammatory factors, oxidative stress indexes and coagulation factors in the ear vein of white rabbits.
MethodsForty New Zealand white rabbits were randomly divided into control group, 4-day indwelling group, 6-day indwelling group and 8-day indwelling group, with 10 rabbits in each group. In the indwelling groups, the ear vein of the rabbit was punctured with intravenous indwelling needles. Blood and ear vein samples were collected on the 4th, 6th and 8th days after indwelling, and blood routine tests were performed. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was used to detect the levels of interleukin (IL)-1, IL-6 and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) in ear vein vascular tissue and levels of serum thromboxane B2 (TXB2), 6-keto-prostaglandin F1a (6-keto-PGF1a) and endothelin 1 (ET-1). Biochemical methods was used to measure the levels of malondialdehyde (MDA), the activities of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in ear vein vascular tissue. Hematoxylin and eosin (HE) staining was used to observe the histopathological changes of rabbit ear veins.
ResultsCompared with the the other three group, the levels of white blood cells (WBC), platelet (PLT), neutrophilic granulocyte percentage (Gran), IL-1, IL-6, TNF-α, MDA, TXB2, ET-1, the degree of vascular inflammation and the incidence of thrombosis were significantly increased in the 8-day indwelling group, while the activity of SOD, GSH-Px and the level of 6-keto-PGF1a were significantly decreased(P < 0.05).
ConclusionIndwelling time of indwelling needles for more than 6 days will increase inflammatory factors in ear veins, induce oxidative stress, and aggravate phlebitis and thrombosis.
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Keywords:
- indwelling needle /
- inflammation /
- oxidative stress /
- coagulation factor /
- vein
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急性脑梗死(ACI)起病急，需及时进行有效的治疗，故早期快速而准确地诊断病情非常重要[1]。动脉粥样硬化形成颈动脉狭窄、闭塞，造成脑组织局部缺血或颈内动脉急性闭塞、斑块脱落是ACI发病的重要机制，颈动脉狭窄程度与ACI的发生、病情程度、预后均有紧密关联[2]。微小RNA(miRNA)目前已被应用于相关疾病的临床诊断与鉴别中，其中微小RNA-15b(miR-15b)、微小RNA-210(miR-210)是目前热门关注miRNA。miR-210已被证实与脑损伤、神经元凋亡有一定联系[3], 可能也与ACI颈动脉狭窄程度相关。此外相关研究[4]表明, miR-210表达与ACI患者炎症反应密切相关。除miRNA外，炎症反应也参与了ACI患者颈动脉狭窄进程，多种炎症因子表达异常与颈动脉狭窄有关[5]。炎症因子中，白细胞介素-17(IL-17)被证实能诱导粒细胞集落刺激因子表达，增加基质金属蛋白酶表达，可诱导斑块破裂，与动脉粥样硬化关系密切[6]。由此推测, miR-210、IL-17可能与ACI患者颈动脉狭窄程度也存在一定联系，但目前尚未明确。本研究重点分析了miR-210、IL-17与ACI患者颈动脉狭窄程度的相关性，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
本研究选择本院2019年1月—2020年12月收治的95例ACI患者作为研究对象，患者与家属均对研究知情且自愿签署同意书。纳入标准: ①符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[7]中ACI的诊断标准，并经脑部CT或MRI检查确诊ACI者; ②颈动脉超声检查确诊颈动脉狭窄者; ③病变部位为颈内动脉供血区域者。排除标准: ①短暂性脑缺血者; ②有脑梗死病史者; ③合并其他心脑血管疾病者; ④合并感染性疾病或免疫性疾病者; ⑤近期(1个月内)使用免疫抑制剂或抗炎药物者。95例患者中，男58例，女37例; 年龄43~85岁，平均60.00岁(58.00, 62.00); 体质量指数为18.23~25.75 kg/m2, 平均22.02 kg/m2 (21.83, 22.27); 发病至入院时间3~12 h, 平均7.24 h(6.72, 7.61)。
1.2 方法
1.2.1 血清指标检测方法
① 炎症因子水平。采集4 mL空腹静脉血, 3 500转/min(半径10 cm)离心10 min, -20 ℃下保存待测，使用上海酶联免疫科技有限公司提供的试剂盒以酶联免疫法测定IL-17、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。② miRNA水平。采集2 mL空腹静脉血, 3 000转/min(半径12 cm)离心10 min, -80 ℃下保存待测。加入1 mL的Trizol RNA(美国Invitrogen公司)提取RNA，使用紫外分光光度计(美国THERMO公司, ND-1000N)检测RNA总纯度，达标(1.8~2.0)后通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)用2﹣△△Ct法[△Ct=Ct(miR-15b)-Ct(U6)、△Ct=Ct(miR-210)-Ct(U6)]计算血清miR-15b、miR-210相对表达水平。
1.2.2 颈动脉狭窄程度评估方法和分组方法
患者入院后1周内完成相关检查，通过数字减影血管造影(DSA)、CT血管成像(CTA)等影像学检查方法测定颈动脉狭窄范围。根据颈动脉狭窄范围评估患者颈动脉狭窄程度为重度狭窄(狭窄范围>70%)、中度狭窄(狭窄范围为50%~70%)、轻度狭窄(狭窄范围 < 50%)，并分别纳入重度狭窄组、中度狭窄组、轻度狭窄组。
1.3 统计学分析
采用SPSS 24.0统计学软件进行数据处理，计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，偏态分布的数据以[M(P25, P75)]表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，血清指标与ACI患者颈动脉狭窄程度的相关性采用Kendall′s tau-b相关性分析检验，偏态分布变量间相关性采用Spearman相关性分析检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 颈动脉狭窄程度
本研究95例ACI患者颈动脉狭窄范围的检查结果显示, 23例(24.21%)患者颈动脉狭窄范围>70%, 属于重度狭窄, 40例(42.11%)患者颈动脉狭窄范围为50%~70%, 属于中度狭窄, 32例(33.68%)患者颈动脉狭窄范围 < 50%, 属于轻度狭窄。
2.2 3组ACI患者基线资料及血清指标水平比较
3组患者性别、年龄、体质量指数、发病至入院时间比较，差异无统计学意义(P>0.05); 重度狭窄组患者miR-15b、miR-210表达水平低于中度狭窄组、轻度狭窄组患者, IL-17、IL-1β、TNF-α水平高于中度狭窄组、轻度狭窄组患者，中度狭窄组患者miR-15b、miR-210表达水平低于轻度狭窄组患者, IL-17、IL-1β水平高于轻度狭窄患者，差异均有统计学意义(P < 0.05); 中度狭窄组患者TNF-α水平与轻度狭窄组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
表 1 3组ACI患者基线资料及血清指标水平比较[n(%)][M(P25, P75)]项目 重度狭窄组(n=23) 中度狭窄组(n=40) 轻度狭窄组(n=32) 性别 男 14(60.87) 24(60.00) 20(62.50) 女 9(39.13) 16(40.00) 12(37.50) 年龄/岁 60.00(59.00, 62.00) 60.50(58.00, 62.50) 60.00(57.00, 62.00) 体质量指数/(kg/m2) 21.93(21.71, 22.22) 22.08(21.88, 22.29) 21.99(21.87, 22.22) 发病至入院时间/h 7.15(6.69, 7.36) 7.30(6.95, 7.71) 7.24(6.57, 7.51) miR-15b 2.01(1.61, 2.30) 2.39(2.00, 2.70)* 2.85(2.38, 3.36)*# miR-210 1.12(0.94, 1.21) 1.46(1.33, 1.62)* 1.97(1.82, 2.15)*# IL-17/(μg/L) 13.96(12.90, 15.28) 11.43(9.98, 12.34)* 9.38(8.36, 10.46)*# IL-1β/(μg/L) 5.01(4.29, 5.41) 4.48(3.88, 4.96)* 3.57(3.14, 4.17)*# TNF-α/(μg/L) 4.59(3.98, 4.82) 3.84(3.53, 4.36)* 3.70(3.14, 4.09)* miR-15b: 微小RNA-15b; miR-210: 微小RNA-210; IL-17: 白细胞介素-17; IL-1β: 白细胞介素-1β;
TNF-α: 肿瘤坏死因子-α。与重度狭窄比较, *P < 0.05; 与中度狭窄比较, #P < 0.05。2.3 血清指标与ACI患者颈动脉狭窄程度的相关性分析
Kendall′s tau-b相关性分析显示, miR-15b、miR-210与ACI患者颈动脉狭窄程度呈负相关(P < 0.001), 而IL-17、IL-1β、TNF-α与ACI患者颈动脉狭窄程度呈正相关(P < 0.001)。见表 2。
表 2 血清指标与ACI患者颈动脉狭窄程度的相关性血清指标 r P miR-15b -0.594 < 0.001 miR-210 -0.910 < 0.001 IL-17 0.801 < 0.001 IL-1β 0.599 < 0.001 TNF-α 0.440 < 0.001 miR-15b: 微小RNA-15b; miR-210: 微小RNA-210;
IL-17: 白细胞介素-17; IL-1β: 白细胞介素-1β;
TNF-α: 肿瘤坏死因子-α。2.4 miR-210与IL-17的相关性分析
Spearman相关性分析结果显示, ACI患者的血清miR-210水平与血清IL-17水平呈显著负相关(rs=-0.697, P < 0.001)。
3. 讨论
ACI是临床常见的脑血管疾病，也是目前导致脑血管疾病患者残疾的因素之一。颈动脉狭窄是ACI患者的主要病因之一，且颈动脉狭窄程度与ACI患者预后情况存在密切联系[8-9]。由此可见，分析ACI颈动脉狭窄程度相关指标对ACI患者的早期诊治具有较为重要意义。ACI患者发病后存在不同程度缺血、缺氧，而缺血、缺氧会影响miRNA变化，多种miRNA在脑缺血、脑缺氧、再灌注损伤等过程中均有一定调节作用[10]。其中, miR-210在脑缺血发生后表达异常，动物实验研究[11]表明, miR-210在脑缺血后血管新生过程中有一定促进作用, miR-210与ACI进展有关。炎性因子介导的炎症免疫反应也参与ACI颈动脉狭窄的发生发展, IL-17是一种分泌于T淋巴细胞亚群的促炎因子，对各种炎症反应均有一定促进作用，可能也与ACI的进展相关[12]。由此推测，miR-210、IL-17可能与ACI颈动脉狭窄程度相关。
本研究相关性分析结果显示, miR-15b、miR-210与ACI患者颈动脉狭窄程度呈负相关，而IL-17、IL-1β、TNF-α与ACI患者颈动脉狭窄程度呈正相关。因miR-15b、IL-1β、TNF-α与ACI患者颈动脉狭窄程度相关系数较小，本研究重点分析miR-210、IL-17与ACI患者颈动脉狭窄程度的关系。miR-210与ACI患者颈动脉狭窄程度相关可能是由于miR-210是一种缺氧激活因子，与机体缺血、缺氧具有紧密联系，而ACI患者存在不同程度的缺血缺氧，从而影响miR-210水平[13]。同时, miR-210在缺氧环境中可促进新生血管形成，从而改善机体缺血缺氧, miR-210低表达可能会降低其减轻脑缺血损伤的作用，弱化miR-210抑制ACI颈动脉狭窄进展的作用[3, 14]。因此，随着miR-210表达水平的降低, ACI患者颈动脉狭窄程度加重。在ACI疾病发生发展进程中，炎症反应起着一定作用, IL-17通过调节炎症因子，诱导中性粒细胞趋化，可增加白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等因子释放，促进动脉粥样硬化形成和发展，从而加重颈动脉狭窄程度[15-16]。同时, IL-17可增加调控因子、粒细胞集落刺激因子等因子生成，而这些细胞因子具有促进动脉粥样硬化的作用[17]。此外, IL-17还会刺激巨噬细胞与平滑肌细胞分泌基质金属蛋白酶，诱导细胞外基质的降解而导致动脉粥样硬化斑块破裂，因此, IL-17间接加重了颈动脉狭窄[18]。相关研究[19]证实, miRNA参与ACI患者的免疫调节、信号传导等，从而影响机体炎症反应，且两者可以相互调节。
本研究Spearman相关性分析结果显示, ACI患者血清miR-210水平与血清IL-17水平呈负相关。分析原因, miR-210对JAK激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号途径具有调节作用，而JAK/STAT涉及多种信息，具有重要的修复和抗炎作用，可能抑制炎症因子，利于IL-17下调[20]。因此, miR-210与IL-17存在联系，两者可能相互作用，共同参与并影响ACI患者的颈动脉狭窄过程。
综上所述，血清miR-210低表达、IL-17高表达与ACI患者颈动脉狭窄程度加重有关，且血清miR-210水平与IL-17水平呈负相关，两者可能相互影响并共同参与ACI患者的颈动脉狭窄过程。
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表 1 不同留置时间对兔血常规指标的影响(x±s)
组别 RBC/(×1012/L) HGB/(g/L) WBC/(×109/L) Gran/% PLT/(×109/L) 对照组(n=10) 6.00±0.57 109.65±12.24 6.50±0.83 67.21±6.48 242.70±28.45 留置4 d组(n=10) 5.90±0.49 108.07±13.52 6.71±0.74 68.54±7.60 245.12±27.36 留置6 d组(n=10) 5.84±0.46 106.49±10.18 6.85±0.79 69.10±7.25 251.08±30.50 留置8 d组(n=10) 5.65±0.52 101.25±12.36 10.31±0.92*#△ 83.35±9.41*#△ 289.20±33.74*#△ RBC: 红细胞; HGB: 血红蛋白; WBC: 白细胞; Gran: 中性粒细胞百分比; PLT: 血小板。与对照组比较, *P < 0.05; 与留置4 d组比较, #P < 0.05; 与留置6 d组比较, △P < 0.05。 
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表 2 不同留置时间对兔耳静脉血管组织炎症因子水平的影响(x±s)
pg/mL 组别 IL-1 IL-6 TNF-α 对照组(n=10) 0.45±0.07 3.25±0.40 2.44±0.32 留置4 d组(n=10) 0.48±0.06 3.40±0.42 2.57±0.30 留置6 d组(n=10) 0.53±0.05 3.51±0.47 2.62±0.29 留置8 d组(n=10) 1.02±0.09*#△ 5.19±0.60*#△ 4.30±0.41*#△ IL-1: 白细胞介素-1; IL-6: 白细胞介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α。与对照组比较, *P < 0.05; 与留置4 d组比较, #P < 0.05; 与留置6 d组比较, △P < 0.05。
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表 3 不同留置时间对兔耳静脉血管组织MDA水平和SOD、CAT活性的影响(x±s)
组别 MDA/(μmoL/mg) SOD/(U/mg) GSH-Px/(U/mg) 对照组(n=10) 40.12±3.73 30.05±3.59 168.23±19.50 留置4 d组(n=10) 43.08±3.92 28.92±3.03 160.04±19.17 留置6 d组(n=10) 44.25±4.06 26.76±3.24 153.62±18.43 留置8 d组(n=10) 58.30±4.14*#△ 15.45±2.18*#△ 127.50±14.35*#△ MDA: 丙二醛; SOD: 超氧化物歧化酶; GSH-Px: 谷胱甘肽过氧化物酶。与对照组比较, *P < 0.05; 与留置4 d组比较, #P < 0.05; 与留置6 d组比较, △P < 0.05。
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表 4 不同留置时间对兔血清TXB2、6-keto-PGF1a、ET-1水平的影响(x±s)
ng/L 组别 TXB2 6-keto-PGF1a ET-1 对照组(n=10) 205.60±13.92 334.25±9.87 40.25±5.37 留置4 d组(n=10) 209.54±15.01 330.76±8.54 42.36±4.70 留置6 d组(n=10) 216.23±16.78 325.80±10.23 45.09±4.82 留置8 d组(n=10) 242.98±19.45*#△ 265.35±7.75*#△ 63.50±5.91*#△ TXB2: 血栓素B2; 6-keto-PGF1a: 6-酮-前列腺素F1a; ET-1: 内皮素1。与对照组比较, *P < 0.05; 与留置4 d组比较, #P < 0.05; 与留置6 d组比较, △P < 0.05。
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表 5 不同留置时间对兔血管组织病理变化的影响[n(%)]
组别 炎症反应程度评分/分 血栓形成 对照组(n=10) 0.61±0.07 0 留置4 d组(n=10) 0.65±0.08 0 留置6 d组(n=10) 0.72±0.10 1(10.00) 留置8 d组(n=10) 2.34±0.19*#△ 4(40.00)*#△ 与对照组比较, *P < 0.05; 与留置4 d组比较, #P < 0.05; 与留置6 d组比较, △P < 0.05。
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