MicroRNA-10a-5p promotes the anti-ovarian cancer effect of shikonin
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摘要:目的
初步探究微小RNA-10a-5p(miR-10a-5p)在紫草素抗卵巢癌中的作用。
方法基于数据库分析miR-10a-5p在肿瘤中的表达水平; 瞬时转染miR-10a-5p mimic及NC, 通过逆转录实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-10a-5p的表达水平; 使用CCK-8实验检测紫草素对SKOV3细胞的半数抑制浓度(IC50); 通过流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期; 活死细胞染色比较细胞死亡情况。
结果miR-10a-5p在多种肿瘤中异常表达, 与对照组相比，转染miR-10a-5p mimic后可上调SKOV3细胞中miR-10a-5p的表达水平约80倍，差异有统计学意义(P < 0.000 1); miR-10a-5p可促进卵巢癌细胞的凋亡，提高SKOV3细胞对紫草素的敏感性，其IC50由2.45 μmol/L降低至1.40 μmol/L, 降幅达42.9%。与NC相比，转染mimic可促进SKOV3细胞的凋亡，差异有统计学意义(6.73%与17.71%, P=0.007 5)。与无紫草素相比，紫草素可显著促进卵巢癌细胞的凋亡，差异有统计学意义(6.73%与82.48%, P < 0.000 1); 且miR-10a-5p可协同紫草素促进SKOV3的凋亡，差异有统计学意义(82.48%与96.80%, P < 0.000 1)。活死细胞染色结果显示, miR-10a-5p联合紫草素使更多细胞显著发生死亡(P < 0.000 1); miR-10a-5p联合紫草素使S期细胞占比显著增高(P < 0.000 1), 从而抑制细胞增殖。通过Targetscan7.2预测发现, GATA6可能是miRNA-10a-5p的一个作用靶点。Kaplan-Meier Plotter数据库分析提示, GATA6的高表达与卵巢癌的不良预后相关，瞬时转染mimic后, GATA6 mRNA和其蛋白表达水平明显著下调(P < 0.000 1)。
结论miR-10a-5p和紫草素均可促进SKOV3凋亡，有协同抗卵巢癌的作用，且miR-10a-5p可显著提高SKOV3细胞对紫草素的药物敏感性，其可能是通过靶向作用于GATA6而产生抑癌作用。
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关键词:
- 卵巢癌细胞 /
- 紫草素 /
- 微小RNA-10a-5p /
- 细胞凋亡 /
- 细胞增殖
Abstract:ObjectiveTo preliminarily explore the role of microRNA-10a-5p (miR-10a-5p) in the anti-ovarian cancer effect of shikonin.
MethodsThe expression level of miR-10a-5p in tumors was analyzed based on database; the expression of miR-10a-5p was detected by reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) after transient transfection of miR-10a-5p mimic and NC; the CCK-8 assay was used to detect half inhibitory concentration (IC50) of shikonin in SKOV3 cells; the cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry; the cell death of each group was compared with the staining of live and dead cells.
ResultsThe miR-10a-5p was abnormally expressed in a variety of tumors. Compared with the control group, the expression level of the miR-10a-5p in SKOV3 cells could be significantly up-regulated by about 80 times after transfecting miR-10a-5p mimic (P < 0.000 1); miR-10a-5p can promote the apoptosis of ovarian cancer cells and improve the sensitivity of SKOV3 cells to shikonin. The IC50 of mir-10A-5P decreased by 42.9% from 2.45 μmol/L to 1.40 μmol/L. Compared with NC group, transfection mimic could significantly promote the apoptosis of SKOV3 cells (6.73% versus 17.71%, P=0.007 5). Compared with the non-shikonin group, shikonin significantly promoted the apoptosis of ovarian cancer cells (6.73% versus 82.48%, P < 0.000 1); in addition, miR-10a-5p could significantly promote the apoptosis of SKOV3 with shikoin (82.48% versus 96.80%, P < 0.000 1). The staining results of live and dead cells showed that miR-10a-5p combined with shiverin caused significant death of more cells (P < 0.000 1); the miR-10a-5p combined with shiverin significantly increased the proportion of S-phase cells (P < 0.000 1), thus inhibiting cell proliferation. GATA6 was predicted to be a target of miRNA-10a-5p by Targetscan7.2. Kaplan-Meier Plotter database analysis suggested that high expression of GATA6 was associated with poor prognosis of ovarian cancer, and the mRNA and protein expression levels of GATA6 were significantly down-regulated after transient transfection with mimic (P < 0.000 1).
ConclusionBoth miR-10a-5p and shikonin can promote the apoptosis of SKOV3 cell, and have the synergistic anti-ovarian cancer effect. And miR-10a-5p can significantly improve the drug sensitivity of SKOV3 cell to shikonin, which may be through targeting GATA6 to produce cancer inhibitory effect.
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Keywords:
- ovarian cancer cell /
- shikonin /
- microRNA-10a-5p /
- cell apoptosis /
- cell proliferation
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肺癌是威胁人类生命安全的恶性肿瘤之一，其发病率与致死率均增长较快。目前，肺癌的联合治疗技术已取得巨大进步，但患者预后仍很差, 5年生存率较低[1-2]。中医药是肺癌患者良好的辅助治疗药物，治疗效果良好，且毒性较小[3-4]。左旋含羞草碱是从含羞草中提取的一种植物氨基酸，可抑制咽鳞状细胞癌细胞生长[5]。然而，左旋含羞草碱能否调控肺癌的发生与发展尚未明确。微小RNA(miRNA)约有22个核苷酸，主要通过对靶基因的翻译抑制及mRNA降解参与疾病的进展过程。研究[6]表明，微小RNA-1301-3p(miR-1301-3p)在肺癌组织和细胞中表达增加，下调miR-1301-3p能够抑制肺癌细胞生长及迁移。本研究探讨左旋含羞草碱对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其可能作用机制，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
人正常肺上皮细胞BEAS-2B、人肺癌细胞A549均购自美国模式培养物集存库(ATCC); DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液、多聚甲醛、结晶紫、噻唑蓝(MTT)均由上海碧云天生物提供; Nanodrop2000c超微量分光光度计、细胞裂解液、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂、96孔反转录仪器和96孔qRT-PCR仪器购自美国Thermo Fisher公司; 寡聚核苷酸包括anti-miR-NC、miR-1301-3p抑制剂、miR-NC、miR-1301-3p模拟物均由广州锐博生物合成; Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司; Transwell试验所用的小室以及Matrigel基质胶购自美国Corning公司; 一抗抗体和二抗抗体由美国Santa Cruz公司提供。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
将A549细胞以4 000个/孔的密度培养于直径9.6 cm的有盖培养皿，随后向孔中加入含不同浓度(100、200、400 μmol/L)左旋含羞草碱的DMEM培养基培养24 h[7], 分别记为左旋含羞草碱低剂量组、左旋含羞草碱中剂量组、左旋含羞草碱高剂量组，另将正常培养的A549细胞记为对照组。为探讨miR-1301-3p对肺癌细胞生物学行为的影响，本研究采用脂质体转染法将miR-1301-3p抑制剂及其对照分别转染至培养的A549细胞，分别记为anti-miR-1301-3p组、anti-miR-NC组。为验证左旋含羞草碱是否可通过调控miR-1301-3p表达而影响肺癌细胞生物学行为，本研究采用脂质体转染法将miR-1301-3p模拟物及其对照分别转染至A549细胞，转染成功后将400 μmol/L左旋含羞草碱添加到每组并培养24 h, 分别记为左旋含羞草碱+miR-1301-3p组、左旋含羞草碱+miR-NC组。
1.2.2 MTT试验
一系列处理后，收集各组A549细胞以2 000个/孔的密度培养于96孔板。根据MTT试剂盒的说明书，向培养皿每孔中加入5 mg/mL MTT试剂20 μL, 并在培养箱中孵育4 h。向每孔加入150 μL二甲基亚砜，以溶解细胞中的甲瓒。随后，使用酶标仪检测样品在490 nm处的吸光度(A)值。最后，根据所测A值计算细胞增殖抑制率，公式为(对照组A-实验组A)/(对照组A-空白组A)×100%。
1.2.3 平板克隆形成实验
不同处理后，收集各组A549细胞以200个/孔的密度培养于12孔板，于5%二氧化碳的培养箱中培养14 d, 培养期间每3 d更换1次DMEM培养基。各组A549细胞用磷酸盐缓冲液洗之后，每孔加入多聚甲醛和1%结晶紫。观察细胞集落形成情况，计数细胞克隆形成数，单个集落的判断标准是细胞团直径大于1 mm, 当集落之间出现相互融合时结束计数。
1.2.4 划痕实验
铺板之前先用马克笔在6孔板背面笔直地画3条横线作为标记，经不同处理后，收集各组A549细胞以2×105个/孔的密度培养于6孔板，放置于5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞长满。用20 μL枪头垂直于孔板背面的横线画1条笔直的道痕，以磷酸盐缓冲液洗涤，将此时作为起始时刻，拍照后将培养板放入培养箱内继续培养24 h后拍照。应用ImageJ软件计算细胞划痕愈合率，公式为(划痕起始宽度-划痕端点宽度)/划痕起始宽度×100%。
1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭能力
于Transwell小室提前铺上Matrigel基质胶。不同处理后，收集各组细胞并以1×105个/孔的密度铺在小室的上室，培养48 h，同时在下室加入含10%胎牛血清的培养液作为化学引诱物。用磷酸盐缓冲液洗涤后，向每孔中加入多聚甲醛和1%结晶紫，最后于显微镜下统计侵袭细胞数。
1.2.6 qRT-PCR
依据Trizol试剂说明书提取细胞RNA，使用微量核酸蛋白分析仪分析RNA浓度，以A260 nm与A280 nm比值(A260/A280)分析RNA纯度，RNA完整性通过将RNA样品在2%琼脂糖凝胶中电泳进行分析, miRNA反转录盒子用于RNA反转录。将SYBR Green试剂10 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、模板2 μL、双蒸水6.8 μL混合后，按照95 ℃预变性2 min, 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环的反应条件，在仪器上进行qRT-PCR。以 U6 为内参，采用2-△△Ct法计算miR-1301-3p相对表达量。
1.2.7 蛋白质印迹法(Western blot)
依据RIPA裂解液说明书提取细胞蛋白，将部分蛋白样品与上样缓冲液混合均匀以100 ℃水煮12 min。使用Nanodrop2000c超微量分光光度计分析剩余一部分蛋白样品浓度。根据测定的蛋白浓度计算40 μg蛋白所需体积，随后按照40 μg蛋白的量对样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 5%脱脂牛奶封闭膜2 h, 分别加入E-cadherin(1∶ 800)、N-cadherin(1∶ 800)和GAPDH(1∶ 2 000)一抗抗体稀释液，再加入二抗稀释液(1∶ 3 000), 滴加eyoECL Plus, 暗室内曝光显影。
1.3 统计学分析
采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计量资料以(x±s)表示, 2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析, P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 左旋含羞草碱对肺癌A549细胞增殖的影响
与对照组比较，左旋含羞草碱低剂量组、中剂量组、高剂量组的肺癌A549细胞增殖抑制率均升高，细胞克隆形成数均减少，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1、图 1。
表 1 不同剂量左旋含羞草碱对肺癌A549细胞增殖的影响(x±s)组别 n 细胞增殖抑制率/% 细胞克隆形成数/个 对照组 3 0±0 98.39±7.12 左旋含羞草碱低剂量组 3 27.46±2.38* 77.95±6.21* 左旋含羞草碱中剂量组 3 45.82±4.42*# 61.11±5.97*# 左旋含羞草碱高剂量组 3 64.85±5.54*#△ 49.16±4.39*#△ 与对照组比较, * P < 0.05; 与左旋含羞草碱低剂量组比较, #P < 0.05;与左旋含羞草碱中剂量组比较, △P < 0.05。 2.2 左旋含羞草碱对肺癌A549细胞迁移、侵袭的影响
与对照组比较，左旋含羞草碱低剂量组、中剂量组、高剂量组的肺癌A549细胞的划痕愈合率、N-cadherin蛋白水平和侵袭细胞数均降低, E-cadherin蛋白水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2、表 2。
表 2 不同剂量左旋含羞草碱对肺癌A549细胞迁移、侵袭能力的影响(x±s)组别 n 划痕愈合率/% 侵袭细胞数/个 E-cadherin蛋白 N-cadherin蛋白 对照组 3 71.78±6.12 122.72±11.04 0.23±0.03 0.57±0.05 左旋含羞草碱低剂量组 3 55.12±4.17* 91.25±7.95* 0.38±0.03* 0.43±0.04* 左旋含羞草碱中剂量组 3 41.05±4.07*# 73.72±6.15*# 0.52±0.05*# 0.31±0.03*# 左旋含羞草碱高剂量组 3 27.55±2.62*#△ 53.57±5.01*#△ 0.68±0.05*#△ 0.19±0.02*#△ 与对照组比较, * P < 0.05; 与左旋含羞草碱低剂量组比较, #P < 0.05; 与左旋含羞草碱中剂量组比较, △P < 0.05。 2.3 miR-1301-3p在BEAS-2B细胞和肺癌A549细胞中的表达
A549细胞的miR-1301-3p表达量为(3.59±0.28), 高于BEAS-2B细胞的(1.00±0), 差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.4 左旋含羞草碱对肺癌A549细胞miR-1301-3p表达的影响
左旋含羞草碱低剂量组、左旋含羞草碱中剂量组、左旋含羞草碱高剂量组的miR-1301-3p表达量均高于对照组，且剂量越高, miR-1301-3p表达量越低，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 不同剂量左旋含羞草碱对肺癌A549细胞miR-1301-3p表达的影响(x±s)组别 n miR-1301-3p 对照组 3 1.00±0.00 左旋含羞草碱低剂量组 3 0.81±0.06* 左旋含羞草碱中剂量组 3 0.63±0.05*# 左旋含羞草碱高剂量组 3 0.47±0.04*#△ 与对照组比较, * P < 0.05;与左旋含羞草碱低剂量组比较, #P < 0.05;与左旋含羞草碱中剂量组比较, △P < 0.05。 2.5 下调miR-1301-3p对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响
与anti-miR-NC组比较, anti-miR-1301-3p组的细胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达升高, miR-1301-3p表达、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、划痕愈合率和N-cadherin蛋白表达降低，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3、表 4。
表 4 干扰miR-1301-3p对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响(x±s)指标 anti-miR-NC组(n=3) anti-miR-1301-3p组(n=3) miR-1301-3p 1.00±0.00 0.35±0.04* 细胞增殖抑制率/% 6.24±0.45 55.33±5.12* 细胞克隆形成数/个 95.55±7.12 54.38±5.13* 划痕愈合率/% 73.11±6.41 33.51±3.26* 侵袭细胞数/个 124.04±11.35 60.53±5.34* E-cadherin蛋白 0.21±0.02 0.61±0.05* N-cadherin蛋白 0.59±0.04 0.25±0.02* 与anti-miR-NC组比较, * P < 0.05。 2.6 miR-1301-3p过表达可逆转左旋含羞草碱(400 μmol/L)对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用
与左旋含羞草碱+miR-NC组相比，左旋含羞草碱+miR-1301-3p组的细胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表达降低, miR-1301-3p表达、细胞克隆形成数、侵袭细胞数、划痕愈合率和N-cadherin蛋白表达升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 4、表 5。
表 5 miR-1301-3p过表达逆转左旋含羞草碱对肺癌A549细胞的调控作用(x±s)指标 左旋含羞草碱+miR-NC组(n=3) 左旋含羞草碱+miR-1301-3p组(n=3) miR-1301-3p 1.00±0.00 2.77±0.25* 细胞增殖抑制率/% 66.27±5.62 29.12±2.81* 细胞克隆形成数/个 47.38±4.21 89.27±6.57* 划痕愈合率/% 26.45±2.59 60.63±6.12* 侵袭细胞数/个 52.13±5.13 106.63±11.63* E-cadherin蛋白 0.69±0.05 0.35±0.03* N-cadherin蛋白 0.18±0.02 0.48±0.04* 与左旋含羞草碱+miR-NC组比较, * P < 0.05。 3. 讨论
中医药具有抗炎、抗氧化应激与抗肿瘤等功效，可用于减缓肺癌发展进程，其作用机制与调控多种基因或多条信号通路表达有关[8]。miRNA可通过靶向结合靶基因而抑制其表达或翻译，进而调控肺癌细胞生物学行为，相关研究[9-10]已证实miRNA具有作为肺癌诊断及预后生物学标志物的潜力。
左旋含羞草碱可抑制人头颈鳞状细胞癌细胞增殖，并诱导细胞凋亡[11]。研究[12]报道，左旋含羞草碱可通过介导caspase-9表达而促进骨肉瘤细胞凋亡。目前，左旋含羞草碱与肺癌相关性的研究尚极少见，本研究发现左旋含羞草碱可抑制肺癌细胞增殖。上皮-间充质转化(EMT)是一种有助于癌细胞转移的进程，在此转化过程中，癌细胞能同时具有间质性和上皮性特征，另外还涉及N-cadherin表达上调和E-cadherin下调[13-14]。本研究结果显示，左旋含羞草碱能够降低肺癌细胞中N-cadherin蛋白水平和细胞侵袭能力，并增加E-cadherin表达，表明左旋含羞草碱能够抑制肺癌细胞迁移及侵袭，这可能与其能抑制EMT有关。
研究[15]显示, miR-1301-3p能促进胃癌细胞增殖和克隆形成。miR-1301-3p在非小细胞肺癌组织和细胞中表达水平升高，并可通过靶向调控Thy-1表达而促进非小细胞肺癌发展，或可作为评估患者预后的潜在生物学标志物[16]。本研究结果显示，肺癌细胞中miR-1301-3p表达量升高，而左旋含羞草碱可抑制肺癌细胞中的miR-1301-3p表达。本研究还发现，下调miR-1301-3p能够抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，而miR-1301-3p过表达可逆转左旋含羞草碱对肺癌细胞恶性表型的抑制作用。由此提示，左旋含羞草碱可通过下调miR-1301-3p表达而抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭。
综上所述，左旋含羞草碱通过下调miR-1301-3p表达而抑制肺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力，或可成为治疗肺癌的新型药物。但本研究未探讨miR-1301-3p调控肺癌进程的具体机制，未来还需进一步深入研究。
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图 1 miR-10a-5p在泛癌中的表达及其对卵巢癌预后的影响
A: miR-10a-5p在多种肿瘤中的异常表达; B: miR-10a-5p的异常表达对卵巢癌的远期预后无明显影响; C: RT-qPCR检测卵巢癌细胞SKOV3中miR-10a-5p的表达水平。两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。
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图 2 流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡情况
使用Annexin V-FITC和PI染色，通过流式细胞检测细胞凋亡情况，紫草素明显促进细胞凋亡, miR-10a-5p协同紫草素促进了SKOV3细胞凋亡[对各组细胞凋亡比例(Q2+Q3)进行统计学分析]。2组比较, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。
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图 3 活死细胞染色比较miR-10a-5p和紫草素对SKOV3细胞的影响
A: 与对照组相比，对照+紫草素组和10a mimics组组的死细胞占比显著较高, 10a mimics+紫草素组的死细胞占比最高(绿色荧光代表活细胞，红色荧光代表死细胞); B: 各组死细胞的红色荧光占比, 2组比较, **P < 0.01, ****P < 0.000 1。
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图 5 miR-10a-5p和紫草素对SKOV3细胞周期的影响
流式细胞术检测发现, miR-10a-5p联合紫草素使G0/G1期细胞明显减少(P < 0.000 1)、S期细胞增多(P < 0.000 1), 而对G2/M期细胞无明显影响。2组比较, ns P>0.05, *P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1。
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图 6 miR-10a-5p靶向作用于GATA6进而对卵巢癌产生影响
A: 通过Targetscan7.2预测miR-10a-5p和GATA6的特异结合位点; B: 通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析GATA6对卵巢癌预后的影响; C、D: 瞬时转染miR-10a-5p mimic后GATA6 mRNA和其蛋白表达水平(两者比较, ****P < 0.000 1)。
表 1 miR-10a-5p和常见相互作用的药物汇总表
化合物 疾病 相关支持实验 顺铂 血液系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤(含卵巢癌)、乳腺癌、肺癌 Luciferase reporter assay//Northern blot//qRT-PCR//MTT assay//TaqMan miRNA assay 阿霉素 血液系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤(含卵巢癌)和视神经脊髓炎等良性疾病 Western blot//qRT-PCR//MTT assay//qPCR 紫杉醇 血液系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤(含卵巢癌)以及神经系统疾病等 qRT-PCR//MTT assay 
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