Effect and mechanism of oxyhydrogen machine in antifungal adjuvant therapy
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摘要:目的
基于体外试验研究氢氧机单独应用或联用抗真菌药对真菌的作用效果及作用机制。
方法选择临床分离获得的12株病原真菌作为试验菌株, 使用氢氧机按固定的流速和档位(气流量3 L/min, 雾化档5档)处理菌悬液，以通气0 min时(未通气时)和通气处理菌悬液5、10 min时为3个观察时点，各时点分别取菌悬液100 μL涂布于沙氏葡萄糖琼脂培养基，于37 ℃温箱内培养2 d后进行菌落计数，计算存活率和杀伤率。采用微量液基稀释法测定4种抗真菌药伏立康唑(VOR)、泊沙康唑(POS)、氟康唑(FLU)、伊曲康唑(ITR)的最低抑菌浓度(MIC)。应用流式细胞仪测定细胞内活性氧(ROS)活性变化。
结果氢氧机5 min通气处理对12株菌株的杀伤率与通气0 min比较，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为6.3%~76.2%; 与5 min通气处理相比，氢氧机10 min通气处理对12株菌株的杀伤率增高，差异均有统计学意义(P < 0.05), 整体杀伤率范围为19.6%~93.5%。菌悬液体外药敏试验结果显示，氢氧机通气处理10 min后, ITR、POS、VOR对菌株的MIC值下降了1~4倍, FLU对菌株的MIC值降低了1~5倍; 高浓度氢气处理后，抗真菌药对其中11株菌株的MIC值明显降低。对经过不同时间通气处理的ATCC00279菌株进行细胞内ROS检测发现，与通气0 min比较，通气10 min后菌株对ITR、VOR的ROS百分比增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论单独氢氧机通气处理即可实现高达93.5%的菌株杀伤效果，将其与抗真菌药联用还可使菌株对药物的敏感性增强，进一步降低抗真菌药对真菌的MIC，其机制可能与氢氧机能增强真菌细胞内ROS活性有关。
Abstract:ObjectiveTo explore antifungal effect and mechanism of oxyhydrogen machine alone or combined with antifungal agents based on in vitro study.
MethodsTwelve strains of clinically isolated pathogenic fungi were selected as study strains, and the bacterial suspension was treated with a hydrogen-oxygen machine at a fixed flow rate and gear (gas flow rate of 3 L/min at the fifth atomization gear position). 100 μL of bacterial suspension was respectively coated on Sarge glucose AGAR medium at 0 min of ventilation (without ventilation) and 5 and 10 min of ventilation for bacterial suspension, and colony counts were performed after the medium was cultured at 35℃ for 2 days. Survival rate and kill rate were calculated. The minimal inhibitory concentrations (MICs) were evaluated before or after oxyhydrogen treatment for four antifungal drugs: voriconazole (VOR), posaconazole (POS), fluconazole (FLU), itraconazole (ITR). The intracellular reactive oxygen species (ROS) activity was measured by flow cytometry.
ResultsThe killing rate of 12 strains after 5 min ventilation by hydrogen oxygen machine showed significant difference compared with that at 0 min of ventilation (P < 0.05). The overall killing rate ranged from 6.3% to 76.2%. The killing rate of 12 strains at 10 min of ventilation by hydrogen oxygen machine increased compared with 5 min of ventilation(P < 0.05), with the overall killing rate of 19.6% to 93.5%. The results of external drug sensitivity test of bacterial suspension liquid showed that the MIC values of ITR, VOR, and POS against the strains after 10 min treatment were decreased 1 time to 4 times, and the MIC value of FLU against the strains was reduced 1 time to 5 times. After treatment with high concentration of hydrogen, the MICs of antifungal agents against 11 strains were significantly decreased. The intracellular ROS detection of ATCC00279 strain after different time of ventilation showed that the percentage of ROS in strains by ITR and VOR increased after 10 min of ventilation compared with 0 min of ventilation (P < 0.05).
ConclusionDirectly ventilation by oxyhydrogen machine enables to obtain direct killing of up to 93.5% of the pathogenic fungi. Oxyhydrogen treatment combined with antifungal drugs can increase the susceptibility of the strain to the drugs to further decrease MIC of antifungal agents against fungi. The mechanisms might be associated with the increased intracellular ROS activity of fungal cells by oxyhydrogen machine.
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腰椎管狭窄症已成为60岁以上患者行腰椎手术最常见的原因[1]。根据解剖学分型，腰椎管狭窄可分为中央型、侧隐窝型、椎间孔型，其中侧隐窝狭窄症在临床治疗过程中最为常见[2]。传统开放术式需广泛剥离椎旁肌，大范围切除后方骨与软组织结构，可能造成术后出现顽固性腰痛、腰部僵硬不适、硬膜外瘢痕增生再次对脊髓神经构成压迫以及医源性脊柱不稳等情况。近年来，单通道内镜[经皮内镜下椎管减压术(PELD)]发展迅速，其适应证已扩展至腰椎侧隐窝狭窄症的治疗中，且效果较好[3-5], 但其操作通道与内镜通道同轴，在一定程度上限制了术者的操作。单侧双通道内镜技术(UBE)因更加灵活、高效受到临床重视和推广。然而，上述2种内镜技术下行侧隐窝减压术治疗腰椎侧隐窝狭窄症的优缺点的相关研究较少。本研究回顾性分析2019年10月—2021年1月滨州医学院附属医院脊柱外科治疗腰椎侧隐窝狭窄症的51例患者的临床资料，探讨PELD、UBE术式的安全性、有效性及各自的优缺点，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2019年10月—2021年1月内镜下治疗腰椎侧隐窝狭窄症的患者51例为研究对象。根据不同手术方式分为PELD组29例和UBE组22例。纳入标准: ①临床表现为单侧神经性间歇性跛行、下肢根性疼痛症状，保守治疗超过3个月无效者; ②症状、体征与影像学结果一致，同时CT或磁共振成像(MRI)检查提示侧隐窝前后径 < 4 mm或侧隐窝角 < 30°[6], 同节段可伴或不伴椎间盘突出者; ③均为单节段单侧侧隐窝狭窄者; ④按照要求定期随访，且随访时间超过12个月者; ⑤临床资料完整者。排除标准: ①影像学检查显示存在腰椎不稳或腰椎滑脱Ⅱ度及以上者; ②椎管狭窄责任节段为2个及以上，双侧侧隐窝狭窄，中央管严重狭窄者; ③患者存在腰椎骨折、严重畸形、肿瘤、感染疾病史或者既往有腰椎手术史; ④存在严重马尾神经功能障碍或者存在严重基础疾病而不能耐受手术者。2组患者性别、年龄、病程、病变节段、随访时间等方面比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 1。
表 1 2组患者一般资料(x±s)组别 n 性别 年龄/岁 病程/月 病变节段 随访时间/月 男 女 L3~4 L4~5 L5/S1 PELD组 29 17 12 61.59±8.79 46.34±17.19 5 17 7 12.38±0.78 UBE组 22 11 11 62.45±7.44 42.00±13.73 5 11 6 12.41±0.73 1.2 方法
PELD组(以L4~5为例): 取健侧卧位, 1%利多卡因对术区进行局部麻醉。取皮肤切口约8 mm, 扩张软组织, C型臂透视下，逐级使用骨钻进行初步椎间孔成形，置入工作套管、内镜，镜下视椎间孔狭窄情况，应用镜下骨刀、动力磨钻进行二次椎间孔扩大成形，包括切除部分上关节突腹侧、基底部和椎弓根上缘骨质，暴露黄韧带位于侧方的附着点，扩大侧隐窝骨性通道，咬除增生黄韧带，显露L5神经根，咬除神经根背侧增生黄韧带，背侧压迫解除后旋转工作套管显露神经根腹侧。若伴有椎间盘突出或椎体后缘骨赘，则镜下摘除突出髓核组织，磨钻切除L4、L5椎体后缘骨赘，减压盘黄间隙及椎弓根上隐窝，彻底减压神经根腹侧，然后调整工作套管至远端骨性侧隐窝处，使用磨钻磨除增生骨质，扩大侧隐窝，松解L5神经根。最后射频止血后，探查神经根无压迫，缝合伤口。
UBE组(以L4~5左侧为例): 全身麻醉成功后取俯卧位，透视定位L4~5椎板间隙，于棘突中线旁开1.0 cm、上下距离椎板间隙1.5 cm处，各做横切口约1.0 cm, 而后置入套管。透视确认关节镜通道和工作通道交汇于L4椎板下缘。置入等离子射频(工作通道)和关节镜(观察通道)，处理软组织，显露L4~5椎板间隙上下缘骨质及黄韧带，使用常规枪钳或磨钻去除部分L4椎板下缘、L5椎板上缘骨质，显露黄韧带上、下缘于椎板的附着点，神经剥离子松解黄韧带与硬膜囊，去除增生黄韧带。应用常规咬骨钳向外侧去除增生的关节突关节至椎弓根内壁，显露L5左侧神经根，解除压迫，若存在椎间盘突出则向内拉开L5神经根，去除腹侧压迫，彻底减压。射频止血后，探查神经根无压迫，缝合伤口(一般不放置引流)。
2组均术后当天即进行下肢直腿抬高和腰背肌功能锻炼，鼓励患者早期使用腰椎固定带辅助下床活动, 3个月内避免重体力劳动。
1.3 观察指标
记录2组患者手术时间、透视次数、切口长度、术后卧床时间；分析2组患者术前和术后3 d、3个月及末次随访时腰、腿部疼痛视觉模拟评分法(VAS)评分、Oswestry功能障碍指数(ODI)。末次随访时，采用改良MacNab标准[7]进行疗效评定。
1.4 统计学分析
采用SPSS 23.0软件进行数据分析，计量资料采用(x±s)表示。2组患者手术时间、透视次数、切口长度、随访时间、术后卧床时间、术前及术后时间段腰腿部VAS评分、ODI评分等比较采用独立样本t检验; 性别、手术节段等计数资料比较采用卡方检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组围术期指标比较
PELD组切口长度短于UBE组，术中透视次数多于UBE组，差异有统计学意义(P < 0.05); 2组手术时间、术后卧床时间比较，差异均无统计学意义(P>0.05), 见表 2。由于手术是在水介质下完成, 2组术中出血量无法精确计算，且出血量均 < 50 mL, 未纳入比较。
表 2 2组围术期指标比较(x±s)组别 n 手术时间/min 术中透视次数/次 切口长度/cm 术后卧床时间/h PELD组 29 56.21±11.31 6.21±1.66* 0.93±0.10* 8.41±5.79 UBE组 22 53.18±7.49 2.23±0.81 2.26±0.51 10.95±4.42 与UBE组比较, * P < 0.05。 2.2 2组术前和术后VAS评分和ODI比较
术后3 d、3个月及末次随访时, 2组腰痛、腿痛VAS评分及ODI均低于术前，差异有统计学意义(P < 0.05); 术后3 d, PELD组腰痛VAS评分低于UBE组，差异有统计学意义(P < 0.05)。术前、术后3个月及末次随访时, 2组腰痛VAS评分比较，差异无统计学意义(P>0.05); 术前和术后3 d、3个月及末次随访时, 2组腿痛VAS评分及ODI比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
表 3 2组腰腿痛VAS评分和ODI比较(x±s)指标 时点 PELD组 UBE组 腰痛VAS评分/分 术前 5.00±1.07 4.96±0.84 术后3 d 2.76±0.79*# 3.18±0.59* 术后3个月 1.86±0.44* 2.05±0.58* 末次随访 1.00±0.38* 1.18±0.50* 腿痛VAS评分/分 术前 7.17±0.76 7.09±0.61 术后3 d 2.52±0.69* 2.46±0.60* 术后3个月 1.79±0.62* 1.64±0.58* 末次随访 1.21±0.56* 1.23±0.53* ODI/分 术前 60.41±12.25 59.00±7.11 术后3 d 27.14±3.22* 29.00±3.80* 术后3个月 19.76±3.55* 20.41±3.20* 末次随访 12.66±3.56* 13.73±3.24* VAS: 视觉模拟评分法; ODI: Oswestry功能障碍指数。
与术前比较, * P < 0.05; 与UBE组比较, # P < 0.05。2.3 2组患者并发症和临床疗效比较
2组患者均顺利完成手术，均无感染、切口不愈合、硬膜外血肿。PELD组中1例患者术后出现下肢感觉过敏，麻木伴疼痛，给予止痛、营养神经等保守治疗3个月后好转; 1例椎弓根水平侧隐窝骨性狭窄患者，术后有部分下肢症状残留。UBE组中1例患者术中出现硬膜撕裂，撕裂口小于3 mm, 未见马尾神经疝出，给予严密缝合伤口，卧床1周，患者未见明显不适; 1例关节突增生较重患者，术后复查CT时见关节突关节损伤较大，超过50.0%, 随访时无明显不适。末次随访时, PELD组改良MacNab标准优良率为89.7%(26/29), UBE组为90.9%(20/22), 差异无统计学意义(P>0.05)。
3. 讨论
目前，关于侧隐窝狭窄的定义尚存有争议[8]。研究[9]认为，侧隐窝狭窄为上关节突前方所对应的区域，即包括了盘黄间隙及部分椎体后方的骨性侧隐窝。侧隐窝狭窄常见于椎间盘退变，导致椎间高度丢失、黄韧带皱缩、椎间盘突出、黄韧带增生肥厚、椎体后缘骨赘形成及神经根压迫，造成患者下肢根性症状。临床上，神经根在盘黄间隙和下位椎体上缘至椎弓根中段的骨性侧隐窝造成的压迫最为常见。本研究中, 51例侧隐窝狭窄症患者均为该区域狭窄。
近年来, PELD技术逐渐被广泛应用于腰椎疾患的治疗中，广义上的单通道PELD可分为经椎间孔入路和经椎板间入路[10]。经椎间孔入路PELD适用于椎间孔狭窄及侧隐窝狭窄，而经椎板间入路适用于侧隐窝狭窄及中央型椎管狭窄[11]。本研究中, PELD均为经椎间孔入路，也证实了该技术治疗腰椎侧隐窝狭窄症的临床疗效较好，与术前比较，术后各时间点腰痛及腿痛VAS评分、ODI均得到了显著改善，末次随访优良率为89.7%。而经椎板间的PELD在行减压时，对于关节突关节的保护和术后椎管容积扩张效果差于UBE技术[12]。分析原因在于PELD技术灵活性上弱于UBE, 不能灵活摆动减压的角度来切除内聚的关节突关节，存在过多切除，进而导致术后腰椎不稳的风险[13]。本研究中, UBE组临床疗效较满意，其术后各时间点腰痛及腿痛VAS评分、ODI相较于术前均有显著改善，末次随访优良率为90.9%。PELD、UBE技术下行侧隐窝减压治疗腰椎侧隐窝狭窄症各有优缺点。本研究中, PELD的优势在于: ① PELD组均是在局部麻醉下完成，而UBE组需全身麻醉，对于合并严重基础疾病的老年患者可以考虑选择PELD, 可避免因全身麻醉禁忌而失去手术机会。② PELD组在术后3 d腰痛VAS评分优于UBE组，分析其原因首先在于PELD组的手术切口较UBE组小，其次相较于经椎间孔入路PELD技术，UBE技术对于腰后方肌肉软组织及关节突关节的损伤较大。③ PELD技术对于神经根腹侧减压更为直接，能够通过扩大椎间孔(磨除部分上关节突腹侧及椎弓根上缘)完成侧方及腹侧的减压。UBE组的优势在于: ① UBE组术中透视次数显著少于PELD组，证实UBE技术在术中透视次数方面有优势，可减少对术者和患者的放射性损害。②术者可使用熟悉的常规手术器械，无需昂贵的PELD专用器械。③ UBE技术是从后方椎板间切除部分椎板及关节突关节进入侧隐窝，对于神经根后方的减压更有优势。④可使用30°镜头，术中可切换视角来扩大术野范围，不易形成盲区，且其摆动的角度均较PELD大，便于完成彻底减压。
虽然2组都取得了满意的疗效，但仍需注意相关手术并发症。在PELD组中，有1例椎弓根水平侧隐窝狭窄，术后患者残留部分下肢症状，复查CT见侧隐窝减压欠充分，故术前仔细查体，并结合影像学检查，明确需减压的区域，术中做到精准减压，才能更好地保证手术效果。另有1例患者术后出现下肢感觉疼痛过敏、麻木，经给予止痛、营养神经治疗3个月后好转，提示术中需操作细致，避免对神经根的副损伤。UBE组中有1例患者出现硬膜撕裂(约3 mm), 给予严密缝合伤口，术后严格卧床，患者未见明显不适。在减压时，应优先处理完骨性结构后处理黄韧带，黄韧带可作为保护硬膜、神经组织的屏障，同时注意仔细辨认椎膜韧带，避免牵拉造成硬膜撕裂[14]。另有1例患者术后复查CT见关节突关节损伤较大，超过50.0%, 虽然在短期随访时未见明显异常，但是其长期随访是否会出现腰痛或腰椎不稳还需进一步观察。
综上所述，应用PELD和UBE技术行侧隐窝减压术治疗腰椎侧隐窝狭窄症近期疗效较佳，均具有安全、有效、创伤小、恢复快、术后卧床时间短、并发症少等优点。2种内镜术式各有优缺点, PELD较UBE更微创，仅需局部麻醉即可完成，对于神经根腹侧的减压更优，而UBE灵活性更好，对于神经根背侧减压更彻底，术中透视次数少，故临床需根据患者个体化差异来选择最佳手术方式。但本研究存在局限性，本研究病例数较少，且随访时间短，其远期疗效还需要进一步探讨。
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图 2 各菌株经不同时间通气处理后的残余孢子数量比较
两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1, ns为P>0.05。
表 1 通气不同时间后各菌株的孢子存活率
% 菌株 菌种 0 min 5 min 10 min 382 耳念珠菌 100.0 79.1 50.3 387 耳念珠菌 100.0 80.6 76.1 389 耳念珠菌 100.0 93.7 70.5 Z1 新生隐球菌 100.0 23.8 6.5 Z2 新生隐球菌 100.0 89.7 81.0 Z3 新生隐球菌 100.0 89.1 75.5 SC5314 白念珠菌 100.0 50.4 46.6 ATCC00279 克柔念珠菌 100.0 27.5 17.4 ATCC22019 近平滑念珠菌 100.0 62.2 53.9 R9 耐氟康唑白念珠菌 100.0 91.0 76.9 R14 耐氟康唑白念珠菌 100.0 98.6 97.3 R15 耐氟康唑白念珠菌 100.0 83.6 81.3 
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表 2 4种抗真菌药对12株真菌的体外药敏试验最低抑菌浓度结果
μg/mL 菌株编号 种属 ITR VOR POS FLU 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min 0 min 5 min 10 min AR387 耳念珠菌 0.125 0.125 0.125 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 64.000 64.000 64.000 AR389 耳念珠菌 2.000 1.000 1.000 4.000 2.000 2.000 1.000 0.500 0.250 4.000 2.000 2.000 R9 白念珠菌 1.000 0.250 0.250 0.500 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 4.000 2.000 1.000 R14 白念珠菌 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.500 0.250 0.250 4.000 2.000 2.000 R15 白念珠菌 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.500 0.250 0.125 8.000 4.000 4.000 Z1 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 1.000 1.000 Z2 新生隐球菌 0.125 0.063 0.063 0.031 0.031 0.031 0.250 0.250 0.250 2.000 0.500 0.500 Z3 新生隐球菌 0.250 0.250 0.250 0.063 0.063 0.063 0.500 0.250 0.250 4.000 4.000 2.000 SC5314 白念珠菌 0.250 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.125 0.063 0.063 0.500 0.125 0.125 ATCC00279 克柔念珠菌 0.250 0.125 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.031 0.250 0.250 0.063 ATCC22019 近平滑念珠菌 0.250 0.250 0.063 0.125 0.125 0.063 0.500 0.250 0.250 2.000 1.000 0.063 AR382 耳念珠菌 4.000 2.000 1.000 4.000 1.000 0.250 4.000 2.000 0.500 64.000 64.000 64.000 ITR: 伊曲康唑; VOR: 伏立康唑; POS: 泊沙康唑; FLU: 氟康唑。
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