Experimental study of microRNA-155-5p regulating epithelial mesenchymal transformation of nasal mucosal epithelial cells by targeting histone deacetylase 1
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摘要:目的
观察微小RNA（miR）-155-5p对人鼻黏膜上皮细胞（HNEPC）上皮间质转化（EMT）的影响及其与组蛋白去乙酰化酶1（SIRT1）的靶向关系。
方法选取2019年5月—2021年12月行鼻内镜手术治疗的患者50例为研究对象。根据是否合并鼻息肉分为慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组36例和慢性鼻窦炎不伴鼻息肉（CRSsNP）组14例，另选取同期行鼻中隔偏曲手术治疗的20例鼻中隔偏曲患者为对照组。将miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、miR-NC及Vector质粒转染至细胞，分为miR-155-5p组、miR-155-5p inhibitor组、miR-NC组和Vector组。实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测细胞、组织miR-155-5p表达水平；Western blot、免疫荧光检测组织、细胞SIRT1、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤黏蛋白（Fibronectin）表达；生物信息学工具、荧光素酶报告实验分析miR-155-5p与SIRT1的靶向关系。
结果CRSwNP组鼻腔黏膜组织miR-155-5p表达水平高于CRSsNP组及对照组，CRSsNP组鼻腔黏膜组织miR-155-5p表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01）。CRSwNP组鼻腔黏膜组织E-cadherin、SIRT1表达水平低于CRSsNP组及对照组，CRSsNP组鼻腔黏膜组织E-cadherin、SIRT1表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。CRSwNP组鼻腔黏膜组织Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平高于CRSsNP组及对照组，CRSsNP组鼻腔黏膜组织Vimentin、α-SMA、Fibronectin表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。上调miR-155-5p促进了HNEPC细胞EMT，沉默miR-155-5p抑制了HNEPC细胞EMT。miR-155-5p负性靶向调控SIRT1。
结论miR-155-5p、EMT相关标记物在CRSwNP中表达升高，上调miR-155-5p可通过负性靶向调控SIRT1促进HNEPC的EMT过程。
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关键词:
- 微小RNA-155-5p /
- 组蛋白去乙酰化酶1 /
- 人鼻黏膜上皮细胞 /
- 上皮间质转化
Abstract:ObjectiveTo observe the effect of microRNA(miR)-155-5p on epithelial mesenchymal transition (EMT) of human nasal epithelial cells (HNEPC) and its targeting relationship with histone deacetylase 1 (SIRT1).
MethodsA total of 50 patients who underwent endoscopic nasal surgery from May 2019 to December 2021 were selected as the research objects. According to whether nasal polyps were complicated or not, the patients were divided into chronic sinusitis with nasal polyps (CRSwNP) group (n=36) and chronic sinusitis without nasal polyps (CRSsNP) group (n=14). At the same time, 20 patients with nasal septum deviation who underwent nasal septum deviation surgery were selected as the control group. MiR-155-5p mimics, miR-155-5p inhibitor, miR-NC and vector plasmids were transfected into cells and divided into miR-155-5p group, miR-155-5p inhibitor group, miR-NC group and Vector group. Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to detect the expression level of miR-155-5p in cells and tissues; western blot and immunofluorescence were used to detect tissue and cell SIRT1, E-cadherin, vimentin α smooth muscle actin (α-SMA), fibronectin expression; the bioinformatics tools and luciferase report experiment were used to analyze the targeting relationship between miR-155-5p and SIRT1.
ResultsThe expression level of miR-155-5p in nasal mucosa of the CRSwNP group was significantly higher than that of the CRSsNP group and control group, and the expression level of miR-155-5p in nasal mucosa of the CRSsNP group was significantly higher than that of the control group (P < 0.01). The expression levels of E-cadherin and SIRT1 in nasal mucosa of the CRSwNP group were significantly lower than those of the CRSsNP group and control group, and the expression levels of E-cadherin and SIRT1 in nasal mucosa of the CRSsNP group were significantly lower than those of the control group (P < 0.05). The expression levels of Vimentin, α-SMA and Fibronectin innasal mucosa of the CRSwNP group were significantly higher than those in the CRSsNP group and control group, and the expression levels of Vimentin, α-SMA and Fibronectin in nasal mucosa of the CRSsNP group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05). Up-regulation of miR-155-5p promoted the EMT process of HNEPC cells, while silencing miR-155-5p inhibited the EMT process of HNEPC cells. MiR-155-5p negatively targets SIRT1.
ConclusionThe expressions of miR-155-5p and EMT related markers are increased in CRSwNP. Up-regulation of miR-155-5p can promote the EMT process of HNEPC by negatively targeting SIRT1.
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神经阻滞目前在骨科手术围术期镇痛中应用广泛，罗哌卡因也是最常用的长效局部麻醉药，然而单次注射罗哌卡因的镇痛持续时间不够理想[1], 多数患者会在夜间出现疼痛，影响睡眠质量。舒芬太尼复合罗哌卡因可加强神经阻滞的镇痛效果，延长镇痛时间和降低局部麻醉药物剂量[2]。红细胞作为药物载体，是优化药物生物效应，有效延长药物在体内的半衰期，延长药物作用时间等新型技术[3]。本研究观察罗哌卡因复合红细胞包蔽舒芬太尼改善臂丛神经阻滞的术后镇痛效果，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选择2021年6月—2022年8月90例行择期锁骨或肱骨切开复位内固定术的患者，年龄18~65岁，性别不限。入选标准: 美国麻醉医师协会(ASA)分级Ⅰ~Ⅱ级者; 体质量指数(BMI)为18.5~28.0 kg/m2者。排除存在凝血功能障碍、周围神经病变、严重心肝肾障碍、长期阿片类药物或其他止痛药物使用史和拒绝神经阻滞者，剔除术中出现局部麻醉药中毒反应，严重高血压、低血压和心律失常者。采用随机数字表法将入选者随机分为对照组(C组)、罗哌卡因复合舒芬太尼组(S组)和罗哌卡因复合红细胞包蔽舒芬太尼组(R组)，每组30例。
1.2 麻醉方法
术前取患者静脉血3 mL, 将肝素抗凝的静脉血与50%葡萄糖注射液2 mL混合均匀，在室温(20~23 ℃)下静置，以2 000转/min离心30 min, 去除上清液后于密集红细胞中加入10 μg舒芬太尼，摇匀后再静置20 min, 制备成红细胞包蔽舒芬太尼溶液。
患者入室后监测无创血压(NBP)、心电图(ECG)和脉搏血氧饱和度(SpO2)。开放外周静脉，静注咪达唑仑0.03 mg/kg。患者取仰卧位，将探头横置于颈动脉搏动处，缓慢向外侧滑动探头，辨认肌间沟内低回声臂丛。在平面内进针回抽无血后注射药物，确认局部麻醉药包绕神经。C组给予0.375%罗哌卡因20 mL, S组给予0.375%罗哌卡因复合舒芬太尼0.5 μg/mL的混合液20 mL, R组给予0.375%罗哌卡因复合红细胞包蔽同等剂量舒芬太尼的混合液20 mL。本研究所有药物均由专人配置，所有操作均由同一位麻醉医师完成。
阻滞成功后给予丙泊酚2 mg/kg, 芬太尼3 μg/kg, 顺式阿曲库铵0.15 mg/kg静脉推注，诱导完成后行气管内插管。呼吸机调为容量控制模式，呼吸参数: 潮气量8 mL/kg, 呼吸频率12次/min, 氧流量2 L/min, 将呼气末二氧化碳分压保持在35~40 mmHg。诱导后，持续静脉泵注丙泊酚50~100 μg/(kg·min)和瑞芬太尼0.02~0.06 μg/(kg·min)维持麻醉，术中间断追加顺式阿曲库铵，维持脑电双频指数(BIS)值45~60。术毕待患者清醒后拔管。3组患者均在术后使用静脉自控镇痛(PCIA), PCIA内药物配制: 使用生理盐水将舒芬太尼1.5 μg/kg、阿扎司琼10 mg配置至100 mL, 持续静脉输注剂量1.5 mL/h, 自控追加量1.5 mL, 锁定时间10 min, 持续镇痛48 h。
1.3 观察指标
记录感觉和运动阻滞起效时间。采用针刺实验对大鱼际、小鱼际和虎口等神经支配区域进行评定(0级为感觉正常，1级为有钝痛感，2级为没有感觉)，记录感觉阻滞起效时间(注药完成至针刺试验2级的时间)。采用改良Bromage分级法评估运动阻滞程度(0级为无麻痹; 1级为不能屈曲肘关节; 2级为不能抬上肢; 3级为不能屈曲指关节)，记录运动阻滞起效时间(注药完成至Bromage分级法3级的时间)。采用视觉模拟评分法(VAS)评估患者术后1、4、12、24、48 h内的最大静态和动态疼痛程度(0分表示没有疼痛，10分表示疼痛剧烈)。记录术后第1次按压镇痛泵的时间及PCIA按压次数。记录术后恶心、呕吐、皮肤瘙痒、呼吸抑制[呼吸频率(RR) < 8次/min]等不良反应。
1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0统计软件对数据进行分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差检验; 非正态分布采用非参数检验。计数资料以[n(%)]表示，组间比较采用χ2检验或者Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
3组患者性别、年龄、BMI、ASA分级、手术位置和手术时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
表 1 3组患者一般资料比较(x±s)[n(%)]组别 n 男 女 年龄/岁 BMI/(kg/m2) ASA分级 手术位置 手术时间/min Ⅰ级 Ⅱ级 锁骨 肱骨 C组 30 11(36.7) 19(63.3) 47.1±13.1 22.9±1.7 14(46.7) 16(53.3) 19(63.3) 11(36.7) 70.9±29.3 S组 30 13(43.3) 17(56.7) 50.6±11.0 23.6±1.0 12(40.0) 18(60.0) 18(60.0) 12(40.0) 68.1±30.1 R组 30 13(43.3) 17(56.7) 51.0±13.1 22.8±1.6 15(50.0) 15(50.0) 20(66.7) 10(33.3) 70.1±34.1 BMI: 体质量指数; ASA: 美国麻醉医师协会。 2.2 感觉和运动阻滞起效时间
3组患者感觉和运动阻滞起效时间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表 2。
表 2 3组患者感觉和运动阻滞起效时间比较(x±s)min 组别 n 感觉阻滞起效时间 运动阻滞起效时间 C组 30 6.9±1.3 11.0±1.6 S组 30 6.4±0.9 10.2±1.0 R组 30 6.8±0.7 11.0±1.5 2.3 不同时点及不同状态下的VAS评分
3组患者术后1、4 h的静态和动态VAS评分比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与C组比较，S组和R组术后12 h的静态及动态VAS评分降低，差异有统计学意义(P < 0.05); 与S组比较, R组术后24 h的静态VAS评分降低，差异有统计学意义(P < 0.05); 与S组比较, R组术后12、24 h的动态VAS评分均降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 3组患者不同时点及不同状态下VAS评分比较(x±s)分 指标 组别 n 术后1 h 术后4 h 术后12 h 术后24 h 术后48 h 静态VAS评分 C组 30 1.6±0.6 2.5±0.6 3.6±0.5 3.8±0.4 4.1±0.5 S组 30 1.7±0.5 2.3±0.6 3.1±0.6* 3.8±0.4 4.0±0.4 R组 30 1.7±0.5 2.3±0.4 3.3±0.4* 3.5±0.5*# 3.8±0.4* 动态VAS评分 C组 30 2.6±0.5 3.3±0.6 4.2±0.7 4.6±0.6 4.8±0.5 S组 30 2.6±0.5 3.2±0.5 3.9±0.5* 4.5±0.5 4.5±0.7 R组 30 2.6±0.5 3.3±0.4 3.6±0.5*# 4.2±0.6*# 4.3±0.6* VAS: 视觉模拟评分法。与C组比较, * P < 0.05; 与S组比较, # P < 0.05。 2.4 镇痛泵使用情况
与C组比较, S组和R组镇痛泵首次按压时间较晚，按压次数较少，差异有统计学意义(P < 0.05)。与S组比较, R组镇痛泵首次按压时间较晚，按压次数较少，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 4。
表 4 3组患者镇痛泵使用情况比较(x±s)[M(P25, P75)]组别 n 首次按压时间/h 按压次数/次 C组 30 10.6±1.4 14.0(12.5, 15.0) S组 30 13.7±1.4* 12.0(11.0, 13.0)* R组 30 14.5±1.3*# 11.0(10.0, 12.0)* # 与C组比较, * P < 0.05; 与S组比较, # P < 0.05。 2.5 不良反应
3组患者均未出现恶心、呕吐、皮肤瘙痒、呼吸抑制等不良反应。
3. 讨论
骨科上肢手术中应用臂丛神经阻滞具有增强镇痛效果、减少麻醉后恢复室滞留时间、减少阿片类药消耗和住院费用等优点[4]。然而，目前的局部麻醉药持续时间较短，尽管加大局部麻醉药用量可使止痛时间延长，但也会增大潜在神经毒性风险[5]。佐剂和局部麻醉药能产生协同镇痛作用，提高局部麻醉药的镇痛效果，并减少潜在药物相关不良反应[6]。研究[7]报道，局部麻醉药联合舒芬太尼应用于臂丛神经阻滞中可延长镇痛持续时间。本研究中，S组术后12 h的静态和动态VAS评分均低于C组，与之前研究结果一致，作用机制可能是舒芬太尼经外周血管进入血液循环与中枢阿片受体结合，起到中枢镇痛的效果[8]。也有研究[9]表明，舒芬太尼是脂溶性阿片类药物之一，经外周神经鞘膜后，可以由膜表面的阿片结合蛋白转运到脊髓背角，与此处阿片受体结合，发挥镇痛作用。除此之外，舒芬太尼在鞘内吸收缓慢可能也是导致镇痛时间延长的一个因素[10]。虽然复合舒芬太尼可延长镇痛时间，但术后24、48 h C组和S组的VAS评分差异无统计学意义(P>0.05), 尚不能满足患者住院期间的镇痛需求。
舒芬太尼具有分子量较小且渗透压低于生理渗透压的特性，可用红细胞作为生物载体[11]。本研究中，3组的运动和感觉阻滞起效时间差异无统计学意义(P>0.05), 而R组术后24 h的静态VAS评分及术后12、24 h的动态VAS评分均低于C组和S组，差异有统计学意义(P < 0.05)。研究结果表明，肌间沟臂丛神经阻滞中应用罗哌卡因复合红细胞包蔽舒芬太尼满足了患者术中麻醉需求的同时延长了术后镇痛时间，这可能由于被包蔽的舒芬太尼通过红细胞膜内外浓度差缓慢释放，从而产生局部持续的协同镇痛作用，另外，可能部分药物经局部组织吸收入血后产生中枢性镇痛作用。镇痛时间的延长也可能与减慢舒芬太尼在鞘内的扩散有关[12]。红细胞作为药物载体具有较好的生物相容性和降解性[13-14], 以往的研究[15-18]表明其不会增高不良反应发生率，与本研究结果一致。
综上所述，肌间沟臂丛神经阻滞中应用罗哌卡因复合红细胞包蔽舒芬太尼能明显延长术后镇痛时间，且未增加不良反应，具有一定可行性。
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图 2 各组鼻腔黏膜组织E-cadherin、Vimentin、α-SMA、Fibronectin及SIRT1表达
A、B: Western blot结果; C: 免疫荧光结果。两者比较, *P < 0.05, **P < 0.01。
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图 4 miR-155-5p与SIRT1的靶向关系
A: miR-155-5p与SIRT1的结合位点; B: 荧光素酶实验结果; C、D: Western blot结果。两者比较, **P < 0.01。
表 1 引物序列
引物 序列 miR-155-5p 上游 5′-CGAGGATCCGGAGGCAAG-3′ 下游 5′-CCGAATTCCAGCTGTCCGG-3′ U6 上游 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ 下游 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ 
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