Mechanism of macrophage extracellular traps induced activation of fibroblast-like synoviocytes in the pathogenesis of rheumatoid arthritis
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摘要:目的
研究巨噬细胞胞外诱捕网(METs)对成纤维样滑膜细胞(FLSs)的作用和相关机制。
方法采用人源单核细胞白血病细胞(THP-1)系体外诱导成巨噬细胞, 分别使用脂多糖(LPS)和干扰素γ(IFN-γ)诱导METs形成。采用Sytox标记外泄的DNA水平; 采用Western blot和免疫荧光法检测METs主要蛋白成分NE和MPO。纯化METs蛋白组分，将人FLSs细胞系分为对照组、METs组、C29组、IAXO-102组和C29+IAXO-102联合干预组，除对照组外，其余组均将纯化的METs蛋白组分加入FLSs培养液中, C29组同时加入Toll样受体(TLR)2抑制剂C29, IAXO-102组加入TLR4抑制剂IAXO-102, C29+IAXO-102联合干预组同时加入C29和IAXO-102。24h后，检测FLSs细胞活力、迁移和侵袭能力。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中白细胞介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶3(MMP-3)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)水平。
结果LPS诱导METs能力强于IFN-γ, 差异有统计学意义(P < 0.05);METs蛋白可以显著增强FLSs细胞活力、滑膜细胞迁移和侵袭能力(P < 0.05);与对照组相比, METs蛋白处理组上清中IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。C29和IAXO-102单用或联用干预能显著降低滑膜细胞的活力、迁移和侵袭能力(P < 0.05);与METs组相比，C29+IAXO-102联合干预组上清中IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平下降，差异具有统计学意义(P < 0.05), 且IAXO-102抑制能力强于C29(P < 0.05)。
结论METs蛋白作为损伤相关模式分子主要通过活化TLR4来进一步激活FLSs, 从而参与RA发病。
Abstract:ObjectiveTo investigate the role of macrophage extracellular traps (METs) on fibroblast-like synoviocytes (FLSs) and related mechanisms.
MethodsA human acute monocytic leukemia cell (THP-1) line was used to induce macrophages in vitro, and lipopolysaccharide (LPS) and interferon γ(IFN-γ) were used to induce METs; Sytox was used to mark the level of leaked DNA; Western blot and immunofluorescence were used to detect NE and MPO in METs. After purification of METs protein components, human FLSs cell lines were divided into control group, METs group, C29 group, IAXO-102 group and C29+IAXO-102 combined intervention group. Except for the control group, purified METs protein components were added to FLSs medium in the other groups. Toll-like receptor (TLR) 2 inhibitor C29 was added to the C29 group, TLR4 inhibitor IAXO-102 was added to the IAXO-102 group, and C29 and IAXO-102 were added to the C29+IAXO-102 combined intervention group. After 24 h, the viability, migration and invasion ability of FLSs cells were detected. The levels of interleukin-6 (IL-6), matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), matrix metalloproteinase 3 (MMP-3) and matrix metalloproteinase 13 (MMP-13) in the culture supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
ResultsLPS induced METs ability was significantly stronger than IFN-γ (P < 0.05). METs protein significantly enhanced FLSs cell viability, synovial cell migration and invasion ability (P < 0.05); compared with the control group, IL-6, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 in the supernatant of METs protein treatment group were significantly increased (P < 0.05). C29 or IAXO-102 alone or their combination could significantly reduce the viability, migration and invasion ability of synovial cells (P < 0.05); compared with METs group, the levels of IL-6, MMP-1, MMP-3 and MMP-13 in the combined intervention group were significantly decreased (P < 0.05), and the inhibitory effect of IAXO-102 was significantly stronger than that of C29 (P < 0.05).
ConclusionMETs proteins as damage-related model molecules are mainly involved in RA pathogenesis by activating TLR4 to further activate FLSs.
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神经母细胞瘤(NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占所有儿童新发肿瘤的8%~10%, 致死例数占儿童肿瘤死亡人数的15%[1]。NB起源于胚胎的交感神经节或肾上腺髓质，好发于肾上腺以及颈、胸、腹部、盆腔的交感肾上腺轴部位，最显著的特征是肿瘤的高度异质性[2]。NB既可表现为自发消退并向良性转化的局部肿瘤，也可表现为对强化治疗耐药并具有侵袭性的高度恶性肿瘤，大多数需要积极治疗干预。即使采用包括手术、化疗、放射治疗(简称放疗)、骨髓移植和免疫治疗在内的综合干预措施，高危NB患儿的总体预后仍不理想。国内研究[3]报道，目前高危NB患儿的5年生存率仍低于50%。术后残留肿瘤床的局部复发是NB患儿预后不良的重要原因[4]。虽然放疗能够有效抑制肿瘤的局部复发[5], 但大剂量放疗有多种副作用，会影响NB患儿的预后。相关研究[6]认为，放疗对降低NB复发率和提升NB患者生存率的影响仍不确定，尚需进一步研究。本研究收集100例高危NB患儿的临床资料进行分析，旨在探讨放疗对高危NB患儿预后的影响，为高危NB的临床治疗提供参考依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
回顾性分析2018年1月—2022年12月苏州大学附属儿童医院普外科收治的100例高危NB患儿的临床资料，包括年龄、性别、肿瘤原发部位、血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、MYCN基因扩增情况, 24 h尿香草扁桃酸(VMA)水平、是否接受放疗、肿瘤复发和转移情况等。100例NB患儿均经病理组织学或骨髓细胞学检查确诊，并根据年龄、MYCN扩增情况、肿瘤分期和病理类型判定为高危患儿。排除标准: ①合并心、肺、肝、肾等重要脏器功能明显受损者; ②合并难以控制的全身感染或脓毒血症者; ③合并严重贫血、消瘦或处于恶病质状态的终末期患者; ④不接受随访或短期内失访者。本研究经过苏州大学附属儿童医院伦理委员会审核批准，所有患儿家属均签署知情同意书。
100例NB患儿中，男56例，女44例; 年龄3~66个月，平均(23.20±19.96)个月，年龄 < 18个月者40例, ≥18个月者60例; 肿瘤原发于肾上腺及腹膜后66例，其他部位(纵隔、颈部及多体腔累及)34例; NB远处转移56例，其中骨转移16例、骨髓转移24例、肝脏转移8例、颅脑转移8例; MYCN基因扩增40例，无MYCN基因扩增60例; 24 h尿VMA < 13.6 mg者54例, ≥ 13.6 mg者46例; 血清NSE < 100μg/L者52例, ≥100 μg/L者48例。根据是否接受放疗，将100例患儿分为放疗组58例和未放疗组42例。
1.2 治疗方案
高危NB的治疗方案一般分为诱导期方案(化疗和手术)、巩固期方案(自体外周血造血干细胞移植及放疗)和维持治疗期方案(免疫治疗联合13-顺式维甲酸治疗)。化疗方案: 根据《儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识CCCG-NB-2021方案》[7]中的原则制订。放疗适应证: 年龄≥18个月的高危NB患儿，若全身情况能够耐受放疗，均需接受放疗; 年龄 < 18个月的高危NB患儿，若肿瘤原发灶短期内增大而影响重要脏器功能或转移灶引起明显症状，例如眼眶部位肿瘤压迫造成视力受损、骨转移引起肢体剧烈疼痛等[8], 也应接受放疗。放疗靶区: 原发部位术后的残留肿瘤床、区域淋巴结和远处转移灶。一般情况下，放疗剂量为21.6 Gy, 分14次(2次/d)或12次(1次/d) 完成; 对于NB肿瘤残留者，局部放疗剂量可增加为30~36 Gy。对于复发患儿，根据具体情况实施个体化挽救性治疗。
1.3 临床分期和危险度分级
参照国际神经母细胞瘤分期系统(INSS)，肿瘤分期分为Ⅰ期、Ⅱa期、Ⅱb期、Ⅲ期、Ⅳ期和Ⅳs期[9]。根据年龄、MYCN基因扩增情况、肿瘤分期和病理类型，危险度分为高危、中危、低危。本研究中, 100例NB患儿的肿瘤分期为Ⅲ~Ⅳ期，危险度分级为高危。
1.4 随访
随访截至2022年12月或患儿死亡、失访，终点事件为复发或死亡，最长随访时间30个月。随访方式为门诊复诊、微信随访或电话随访，随访内容包括是否肿瘤复发、是否死亡、有无远处转移、相关实验室检查及影像学检查结果。
1.5 疗效评估
无复发生存期指确诊至肿瘤复发的时间，总生存期指确诊至全因死亡的时间。
1.6 统计学分析
无复发生存率和总生存率按照确诊至复发或死亡的时间计算，或按照确诊至末次随访的时间计算。采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，样本量n≥40时, T≥5使用卡方检验，任意单元格中T>1~ < 5时，使用连续校正卡方检验。使用Kaplan-Meier法进行生存分析，生存率比较采用Log-rank检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 NB患儿肿瘤复发的单因素分析
100例NB患儿中，复发34例，未复发66例。单因素分析结果显示，年龄、肿瘤远处转移、放疗是NB患儿肿瘤复发的影响因素(P < 0.05), 见表 1。
表 1 NB患儿肿瘤复发的单因素分析[n(%)]因素 分类 复发患儿(n=34) 未复发患儿(n=66) χ2 P 年龄 < 18个月 6(17.65) 34(51.52) 10.725 0.001 ≥18个月 28(82.35) 32(48.48) 性别 男 16(47.06) 40(60.61) 1.671 0.196 女 18(52.94) 26(39.39) 原发部位 肾上腺/腹膜后 24(70.59) 42(63.64) 0.483 0.487 其他 10(29.41) 24(36.36) 远处转移 是 30(88.24) 26(39.39) 21.725 < 0.001 否 4(11.76) 40(60.61) 24 h尿VMA < 13.6 mg 16(47.06) 38(57.58) 0.999 0.318 ≥13.6 mg 18(52.94) 28(42.42) MYCN基因扩增 是 18(52.94) 22(33.33) 3.595 0.058 否 16(47.06) 44(66.67) 血清NSE < 100 μg/L 14(41.18) 38(57.58) 2.418 0.120 ≥100 μg/L 20(58.82) 28(42.42) 放疗 是 12(35.29) 46(69.70) 10.903 0.001 否 22(64.71) 20(30.30) VMA: 香草扁桃酸; NSE: 神经元特异性烯醇化酶。 2.2 NB患儿生存情况的单因素分析
100例NB患儿中，生存74例，死亡26例。单因素分析结果显示，年龄、肿瘤远处转移、MYCN基因扩增是NB患儿生存情况的影响因素(P < 0.05), 见表 2。
表 2 NB患儿生存情况的单因素分析[n(%)]因素 分类 生存患儿(n=74) 死亡患儿(n=26) χ2 P 年龄 < 18个月 36(48.65) 4(15.38) 8.870 0.003 ≥18个月 38(51.35) 22(84.62) 性别 男 38(51.35) 18(69.23) 2.496 0.114 女 36(48.65) 8(30.77) 原发部位 肾上腺/腹膜后 52(70.27) 14(53.85) 2.313 0.128 其他 22(29.73) 12(46.15) 远处转移 是 34(45.95) 22(84.62) 11.676 0.001 否 40(54.05) 4(15.38) 24 h尿VMA < 13.6 mg 42(56.76) 12(46.15) 0.871 0.351 ≥13.6 mg 32(43.24) 14(53.85) MYCN基因扩增 是 20(27.03) 20(76.92) 19.958 < 0.001 否 54(72.97) 6(23.08) 血清NSE < 100 μg/L 42(56.76) 10(38.46) 2.580 0.108 ≥100 μg/L 32(43.24) 16(61.54) 放疗 是 46(62.16) 12(46.15) 2.024 0.155 否 28(37.84) 14(53.85) 2.3 放疗组与未放疗组NB患儿无复发生存率比较
随访记录放疗组与未放疗组NB患儿的无复发生存期，放疗组随访时间为7.36~24.73个月，未放疗组随访时间为6.33~22.60个月。随访期间，放疗组12例患儿复发，复发率为20.69%(12/58), 平均复发时间为19.61个月; 未放疗组22例患儿复发，复发率为52.38%(22/42), 平均复发时间为15.24个月。Kaplan-Meier法生存分析结果显示, 2组患儿无复发生存率比较差异有统计学意义(P < 0.05), 表明放疗可显著提升NB患儿无复发生存率，见图 1。
2.4 放疗组与未放疗组NB总生存率的比较
随访记录放疗组与未放疗组NB患儿的总生存期，放疗组随访时间为9.26~29.77个月，未放疗组随访时间为6.70~25.68个月。随访期间，放疗组、未放疗组分别死亡12、14例，平均总生存时间分别为25.19、20.89个月，总生存率分别为79.31%(46/58)、66.67%(28/42)。Log-rank检验结果显示，2组患儿总生存率比较差异无统计学意义(P>0.05), 表明放疗并不能显著提升NB患儿的总生存率，见图 2。
3. 讨论
NB是一种严重威胁儿童健康的常见恶性肿瘤，在中国的发病率为3/1 000 000~55/1 000 000[10]。NB起病隐匿，多数原发于肾上腺及腹膜后，大部分患儿确诊时已属高危NB, 容易复发和转移，预后较差。NB患儿的肿瘤复发率和生存率可能与多种因素相关。本研究结果显示，年龄、肿瘤远处转移均为NB复发和生存的影响因素(P < 0.05)。刘涛等[11]研究发现，伴有骨转移和颅内转移的高危NB患儿预后较差，其中颅内转移是预后的独立危险因素，但骨髓转移对高危NB预后的影响不明显。本研究中，由于不同部位远处转移的病例数较少，未分别进行统计学分析。MYCN基因扩增可促进肿瘤血管形成和远处转移，与NB的不良预后密切相关[12]。本研究单因素分析结果证实, MYCN基因扩增是NB患儿生存率的危险因素。VMA、NSE在NB的早期诊断和预后判断方面具有一定价值，尤其是NSE>100 ng/mL者预后不佳[13]。但本研究单因素分析结果显示, VMA、NSE水平升高对NB患儿的肿瘤复发率和生存率均无显著影响，考虑与样本量不足以及部分患儿随访时间较短有关[14]。
虽然无事件生存率(EFS)已被认为是评估肿瘤预后的重要指标之一，但仍存在一定局限性。临床事件的概念相对模糊，不仅包括疾病的复发和进展，还包括疾病造成的死亡、治疗带来的副作用和其他意外情况。此外，导致肿瘤进展、复发和患者死亡的机制可能不同，一些已知的预后因素(年龄、INSS分期、远处转移、MYCN基因扩增等)可能难以准确预测NB患儿的肿瘤复发和生存情况。鉴于此，本研究回顾性分析基于无复发生存率的预后因素，并深入了解放疗对NB无复发生存率的影响。国内研究[3]报道，经综合治疗后高危NB患儿的长期生存率仍低于50%, 与国外研究[15]报道的生存率74%相比仍有差距。因诱导化疗效果欠佳或肿瘤被血管包绕，高危NB常无法通过手术完整切除。周珺珺等[16]研究显示，对术后残留肿瘤床辅以局部放疗干预, NB患者的局部控制率和长期生存率相较于完整切除患者并无显著差异，推测放疗对局部控制率和长期生存率的提升有显著作用。本研究中，放疗组与未放疗组的无复发生存率差异有统计学意义(P < 0.05), 表明放疗可显著提升患儿的无瘤生存时间。
目前，传统放疗方法仍有较多副作用，例如高强度放疗可导致患儿发育异常、血管纤维化、甲状腺功能减退等[17], 尤其是大剂量化疗后再进行全身放疗，将可能诱发第2处原发肿瘤。因此，放疗能否提升NB患儿的长期生存率仍未明确[6]。本研究中，放疗组与未放疗组NB患儿的总生存率差异无统计学意义，与单因素分析中放疗因素对NB生存率的影响结果相一致，提示传统放疗难以提升NB患儿的长期生存率。近年来，调强适形放疗、三维适形放疗等精准放疗技术被逐渐应用于临床，其能够增强放疗效果并减轻放疗副作用，或许在改善NB患儿总体生存率方面具有一定意义[18]。
综上所述，年龄、肿瘤远处转移、放疗是NB复发的影响因素，年龄、肿瘤远处转移、MYCN基因扩增是NB患儿生存情况的影响因素。高危NB患儿的治疗目标是降低肿瘤复发率、提升长期生存率和改善生存质量。传统放疗方法能显著提升高危NB患儿的无复发生存率，但不能显著提升总生存率。未来研究者可针对高危NB患儿的预后进一步开展大样本量前瞻性随机对照研究，从而为NB的精准治疗提供参考依据。
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图 1 THP-1细胞系诱导成巨噬细胞
A: THP-1单核细胞系被诱导成巨噬细胞的明场图像; B: THP-1单核细胞系被诱导成巨噬细胞的荧光鉴定，蓝色的DAPI为细胞核，绿色的F4/80为巨噬细胞标记物，标尺为100 μm。
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图 2 LPS、IFN-γ诱导METs的形成能力
A: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分NE与MPO的能力; B: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分外泄的DNA能力的代表性图像，外泄DNA采用绿色的Sytox标记，标尺为100 μm; C: LPS与IFN-γ诱导巨噬细胞产生METs蛋白组分弹性蛋白酶(NE)与髓过氧化物酶(MPO)能力的荧光代表性图像; 蓝色的DAPI为细胞核，绿色的为MPO, 红色为NE, 标尺为100 μm。与LPS诱导METs比较, *P < 0.05, **P<0.01。
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图 3 METs通过TLR2和TLR4促进FLSs活化
A: CCK-8检测各组FLSs细胞的活力; B: 不同处理条件下的FLSs迁移能力结晶紫染色代表性图像，标尺为100 μm; C: 不同处理条件下的FLSs侵袭能力结晶紫染色代表性图像，标尺为100 μm; D: ELISA检测各组FLSs培养上清细胞产生IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13的水平; 与METs单用比较, C29和IAXO-102单用或联用干预后FLSs的活力下降，细胞迁移和侵袭能力减弱，上清IL-6、MMP-1、MMP-3和MMP-13水平增高; 与C29组比较, IAXO-102组抑制能力更强, *P < 0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
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