Preliminary analysis in functions of clinical Streptococcus mutans and 412c-deficient mutant strains
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摘要:目的
分离、纯化和鉴定临床变异链球菌株, 并构建该临床菌株的412c基因缺陷菌株，比较两者生长速率和致龋性。
方法随机收集无龋健康成人口腔牙菌斑样本，在唾液/变异链球菌杆菌肽琼脂(MSA)培养基中进行厌氧培养和筛选，通过菌斑形态观察、革兰氏染色、细菌生化反应和聚合酶链式反应(PCR)等方法对获得的临床分离株进行鉴定; 将线性化重组质粒转入临床变异链球菌中进行同源重组，获得412c(hit)基因缺陷菌株; 在不同pH值脑心浸液(BHI)培养基中，比较两者的生长速率和耐酸特性; 在含3%蔗糖的BHI培养基中，比较两者的产酸能力。
结果无龋健康成人口腔牙釉质表面菌斑在MSA培养基中生长的菌落形态均为深蓝色半球颗粒状突起、表面粗糙、边缘不齐; 革兰氏染色后，显微镜油镜下可见革兰阳性蓝紫色球状菌体，呈长链状和短链状分散; 生化反应和412c基因片段PCR Sanger测序鉴定结果显示，临床变异链球菌为“等效变异链球菌UA159”菌株。将hit-UP-pFW5-Down重组质粒线性化后转入临床变异链球菌中进行同源重组并筛选出412c基因缺陷变异链球菌株，该缺陷菌株生长速率相较其亲本菌株异常快速(与模式菌株ATCC 25175的缺陷菌株相似)，其产酸能力略弱于亲本菌株，耐酸性则显著强于亲本菌株。
结论临床分离变异链球菌株为“等效变异链球菌UA159”菌株，其412c基因与细菌生长调控相关，而412c基因缺陷变异链球菌株的生长速率显著高于其亲本菌株，更具致龋潜力。
Abstract:ObjectiveTo isolate, purify and identify clinical Streptococcus mutans (S.mutans) strains, construct their 412c-deficient mutant strains, and investigate on their proliferation and cariogenicity.
MethodsDental plaque samples were randomly collected from healthy adults without caries, were anaerobically cultivated on saliva or S.mutans bacitracin AGAR (MSA) medium and anaerobion were screened out. The isolated S.mutans strains were identified by colony morphology, Gram staining, biochemical test and polymerase chain reaction (PCR). The linearized recombinant plasmids were transformed into clinical S.mutans strains for homologous recombination to obtain 412c (hit) gene defect strains. The growth rate and acid resistance in the brain heart immersion (BHI) medium with different pH values. In BHI medium containing 3% sucrose, the acid production capacity of the two kinds of strains was compared.
ResultsThe morphology of the dental enamel surface plaque of healthy adults without caries growing in MSA medium was dark blue hemispheric granular protrusions with rough surface and uneven edges. Using Gram staining, there were many long and short chained coccus-shaped bluish violet bacterium under an oil-microscopy. The isolated S.mutans was identified as "an equivalent S.mutans UA159" by biochemical test and PCR-Sanger sequencing of 412c gene segment. The hit-UP-pFW5-Down recombinant plasmids were transformed into the genetic competence of the isolated S. mutans strains. The 412c-deficient mutant strains were screened out. Similar to S.mutans ATCC 25175, the growth rate of the 412c-deficient mutant strains increased greatly compared with their parental S.mutans strains.
ConclusionThe clinical isolate of S.mutans was "equivalent S.mutans UA159" strain, in which the 412c gene is growth-phase regulated, 412c-deficient S.mutans strains have significantly higher growth rates than its parental strain and have more cariogenic potential.
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Keywords:
- Streptococcus mutans /
- 412c gene /
- growth cycle regulation /
- acidogenicity /
- resistance to acid /
- cariogenicity
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急性心肌梗死(AMI)是心内科常见病、多发病，由冠状动脉粥样硬化引起的心脏疾病，临床表现以心前区疼痛、憋闷为主[1]。心力衰竭(简称心衰)是急性心肌梗死的常见并发症，临床表现为水肿、呼吸急促、活动受限等，是导致AMI患者死亡的主要因素之一[2]。人体心脏细胞分泌的内源性脑利钠肽具有利尿、排钠，舒张血管，抑制交感神兴奋性等作用，冻干重组人脑利钠肽是由人工合成的脑利钠肽，具有与人体内源性脑利钠肽相同的生物作用[3]。呋塞米(又称速尿)是临床治疗急性心力衰竭的常用利尿剂药物，具有利尿、消肿的作用，作用机制类似内源性利钠肽，能够纠正心力衰竭，保护心肌细胞[4]。本院在AMI合并心力衰竭的临床治疗中联用新活素和速尿获得了较好的成效，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年1月—2023年12月在扬州大学附属苏北人民医院接受治疗的AMI合并心力衰竭患者。纳入标准: 根据AMI及心力衰竭诊断标准[5-6]明确诊断为AMI合并心力衰竭; 心脏彩超提示左心室增大，左心射血分数(LVEF) < 50%; 冠状动脉造影检查显示≥1支主要冠脉及分支狭窄率超过50%; 患者均在发病12 h内入院; 患者或家属签署知情同意书。排除标准: 入院前应用过他汀类药物治疗者; 对新活素或速尿成分过敏者; 心源性休克或收缩压(SBP) < 90 mmHg (1 mmHg=0.133 kPa); 低心脏充盈压者; 严重肾功能或肺功能异常者; 合并冠心病或其他心脏疾病者; 水电解质紊乱者。
纳入研究152例患者，采用随机抽签法分为对照组和观察组，每组76例。观察组男43例，女33例，年龄55~81岁，平均(65.81±7.43)岁, 纽约心脏病协会(NYHA)心功能分级Ⅰ级15例、Ⅱ级44例、Ⅲ级17例；基础用药包括抗血小板药物53例、抗凝药物62例、抗血栓药物40例、抑制心室重构药物46例、营养心肌药物50例。对照组男45例，女31例，年龄53~80岁，平均(66.14±6.82)岁, NYHA心功能分级Ⅰ级18例、Ⅱ级40例、Ⅲ级18例；基础用药包括抗血小板药物49例、抗凝药物60例、抗血栓药物48例、抑制心室重构药物49例、营养心肌药物47例。2组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。本研究获得了医院伦理委员会的审核批准(伦理号: 2022ky353)。
1.2 方法
患者入院后均立即予以心电监护、血氧饱和度监测、血压检测等，在确认患者的各项生命体征均符合正常标准后，再制定治疗方案。对照组应用呋塞米注射液(芜湖康奇制药有限公司，国药准字H34021984)进行治疗，静脉推注给药，剂量40 mg/d, 持续用药3 d。观察组联合应用冻干重组人脑利钠肽(商品名: 新活素，成都诺迪康生物制药有限公司，国药准字S20050033)和速尿，速尿的用法、用量与对照组相同，新活素通过静脉推注和静脉滴注给药，先静脉推注(剂量1.5 μg/kg, 2~3 min推注完)，再以每分钟0.01 μg/kg的速度滴注给药，持续用药3 d。
所有患者均在上述治疗基础上，同时予以吸氧、镇静镇痛、营养心肌、抗血小板、抗凝、抗血栓、降脂稳斑、改善心脏重构等常规对症治疗。
1.3 观察指标
所有患者治疗前后各进行1次超声心动图检查，测定LVEF、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)。比较2组的心功能指标变化。治疗前后分别采集患者的空腹静脉血，分离保留血清后测定心肌损伤标志物如血肌酐(SCr)、肌红蛋白(Mb)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。测量并比较2组治疗前后的动脉血气指标，包括血氧饱和度(SaO2)、动脉血氧分压[pa(O2)]、动脉血二氧化碳分压[pa(CO2)]。观察患者治疗期间的药物不良反应(如头痛、恶心、低血压、心源性休克、低钠血症、低钾血症等)发生情况。
1.4 疗效评估
治疗结束时进行疗效评估: 治疗后的症状完全消失或明显减轻，心功能下降≥2级为显效; 治疗后的症状缓解，心功能下降1级为有效; 症状及心功能均无改善甚至有加重为无效。
1.5 统计学方法
统计学软件选用SPSS 25.0, 计数资料[n(%)]、计量资料(x±s)比较分别采用χ2检验和t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 心功能变化
与治疗前比较, 2组治疗后LVEF水平升高, LVEDV、LVESV水平下降，观察组LVEF水平高于对照组, LVEDV、LVESV水平低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。
表 1 2组心功能指标变化比较(x±s)组别 时点 LVEF/% LVEDV/mL LVESV/mL 对照组(n=76) 治疗前 40.20±4.88 218.97±40.30 173.30±41.35 治疗后 44.11±7.33* 178.85±41.54* 141.65±46.76* 观察组(n=76) 治疗前 39.33±5.03 220.38±36.11 172.13±35.26 治疗后 53.81±6.70*# 160.87±50.43*# 120.35±34.71*# LVEF: 左心射血分数; LVEDV: 左室舒张末期容积; LVESV: 左室收缩末期容积。与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。 2.2 血清心肌损伤标志物变化
观察组治疗后的血清SCr、CK-MB水平下降, Mb水平升高，且观察组优于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 2组血清心肌损伤标志物水平比较(x±s)组别 时点 SCr/(mmol/L) Mb/(ng/mL) CK-MB/(ng/mL) 对照组(n=76) 治疗前 99.70±9.22 44.03±2.64 0.87±0.19 治疗后 98.49±8.80 46.82±4.33 0.85±0.22 观察组(n=76) 治疗前 98.87±8.31 44.14±2.58 0.88±0.21 治疗后 94.37±7.01*# 48.96±3.72*# 0.71±0.14*# SCr: 血肌酐; Mb: 肌红蛋白; CK-MB: 肌酸激酶同工酶。与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。 2.3 动脉血气指标变化
治疗后2组的SaO2、pa(O2)水平升高, pa(CO2)水平下降，且观察组优于对照组，差异均有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 2组动脉血气指标变化比较(x±s)组别 时点 SaO2/% pa(O2)/mmHg pa(CO2)/mmHg 对照组(n=76) 治疗前 85.87±3.31 65.09±8.21 43.49±5.41 治疗后 89.60±4.35* 75.88±7.13* 39.86±4.22* 观察组(n=76) 治疗前 86.30±3.28 64.54±7.88 44.35±4.87 治疗后 93.21±3.17*# 86.14±6.24*# 35.65±3.70*# SaO2: 血氧饱和度; pa(O2): 动脉血氧分压; pa(CO2): 动脉血二氧化碳分压。与治疗前比较, * P < 0.05; 与对照组比较, #P < 0.05。 2.4 疗效比较
观察组的治疗总有效率为90.79%, 高于对照组的60.53%, 差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.5 不良反应情况
2组用药治疗期间的不良反应总发生率比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 4。
表 4 2组不良反应情况比较[n(%)]组别 恶心呕吐 头痛 低血压 低钠血症 低钾血症 心源性休克 总发生率/% 对照组(n=76) 2(2.63) 1(1.32) 2(2.63) 2(2.63) 1(1.32) 0 10.53 观察组(n=76) 1(1.32) 2(2.63) 2(2.63) 2(2.63) 0 0 9.21 3. 讨论
AMI多由冠状动脉内血栓完全堵塞血管导致心肌细胞缺氧、缺血甚至坏死。心肌细胞长时间缺乏血氧供应，就会发生坏死，而心肌细胞的坏死会直接影响到心脏的收缩及舒张功能，进而影响到全身器官的供血[7]。因此, AMI发生后需要尽早去除血栓，开通血管，以恢复心肌细胞的血氧供应，加快受损心肌细胞的修复。AMI患者在发病后若长时间得不到救治，心肌细胞的损伤将不可逆转，坏死心肌细胞越来越多就容易导致心力衰竭、心源性休克等严重后果[8]。心力衰竭是AMI患者较常发生的并发症之一，心力衰竭即心脏泵血功能衰退，人体各器官的血液供应都有赖于心脏的泵血，而泵血主要通过心肌的有力收缩来实现。心力衰竭的发生表明心肌的收缩能力下降，心脏射血减少，同时也可能存在心肌收缩不同步，血液无法从心室顺利流出而形成湍流，进而出现心脏节律衰竭[9]。伴有心力衰竭的AMI患者由于机体心脏泵血不足无法顺利到达各器官，各器官也容易发生衰竭，所以患者的病情较为危重。
对于AMI合并心力衰竭患者，临床需及时采取治疗措施以控制病情进展，降低患者的死亡风险。心力衰竭的发生及进展与液体潴留密切相关，改善液体潴留有助于缓解患者的病情进展。利尿剂在AMI合并心力衰竭治疗中的应用广泛，速尿是临床常用的利尿药物，其通过发挥利尿作用来缓解机体的液体潴留，从而减轻水肿[10]。研究[11]指出, 30%的心力衰竭患者病情会反复，而反复、大剂量应用利尿剂可能使机体产生耐药性和药物抵抗，从而降低疗效。因此，临床有必要将其与其他药物联用，在降低速尿用量的同时，提高治疗效果。新活素是基于基因重组技术制备的人工人脑利钠肽，在氨基酸序列、生物作用机制方面均与内源性脑钠肽相同，可有效抑制交感神经兴奋、减轻心肌重构、扩张血管[12]。对于传统治疗效果不佳的急性心力衰竭，应用新活素具有较好的效果。陈婷婷等[13]报道显示，新活素治疗绝经后心力衰竭患者后，患者的LVEF、心脏指数(CI)、心排血量(CO)升高，左室舒张末期内径(LVEDD)下降，心功能得到显著改善。本研究中，观察组联合应用新活素和小剂量速尿治疗后，其心功能指标及血清心肌损伤标志物均得到了显著改善，且各指标的改善幅度均比单用速尿的对照组更大，疗效评估也显示观察组的治疗总有效率显著高于对照组。该结果与前述报道一致，证实了其在改善心力衰竭患者心功能方面有确切效果。这一方面是因为新活素可利钠利尿，增加尿量，减轻水肿，降低血容量; 另一方面，新活素能通过多种途径拮抗神经内分泌系统过度兴奋造成的心脏毒性，保护心肌细胞; 另外，新活素还能阻止心肌重塑，抑制心肌增生、间质纤维化，从而降低患者的死亡风险[14-15]。本研究结果还显示，观察组治疗后的血气分析指标改善程度比对照组更显著。该结果表明新活素的联用有助于改善患者的低氧血症，这可能是因为新活素能够改善血流动力学，扩张体肺循环，从而迅速缓解一系列缺氧症状。新活素作为一种新型的抗心力衰竭药物，能够迅速缓解心力衰竭症状，延缓心脏重塑，且该药物无正性肌力作用，不会增加心肌耗氧量，副作用少[16]。本研究也显示, 2组治疗期间的不良反应总发生率接近，可见新活素的加用并未增加不良反应发生风险，这与相关报道相符，证实了新活素用于治疗AMI合并心力衰竭具有较高的安全性。
综上所述, AMI合并心力衰竭患者联用新活素和速尿对心功能、血气指标均有较好的改善作用，其疗效确切且不会增加不良反应，安全性好。值得注意的是，对于合并阻塞性心肌病、限制性心肌病、严重瓣膜狭窄、心包填塞等疾病的患者，并不适宜应用新活素。
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图 1 无龋健康成人口腔牙釉质表面菌斑变异链球菌的鉴定结果
A: MSA培养板上的菌落生长形态; B: 革兰氏染色后油镜下菌落形态(放大倍数10×100); C: 临床变异链球菌株(编号27#~32#)gtfB基因片段PCR产物的核酸电泳结果(ATCC 25175为对照); D: 临床变异链球菌株(编号27#~32#)412c基因片段PCR产物的核酸电泳结果(ATCC 25175为对照); E: 32#临床变异链球菌412c基因片段与变异链球菌UA159(AE014133.2∶386352~386832)、ATCC 25175(NCTC10449) (LS483349.1C∶1665417~1664937)、FDAARGOS_685 (CP050962.1∶726908~727388)基因片段的多重比对结果。
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图 2 临床变异链球菌412c基因缺陷菌株的412c基因片段PCR产物电泳和Sanger测序结果
A: 缺陷菌株(2-5-15-2)412c基因片段PCR产物核酸电泳图; B: 分段测序片段上部分测序图(下板，上板为412c对照); C: 平行缺陷菌株(2-5-16-2)412c基因片段PCR产物核酸电泳图; D: 分段测序片段下部分测序图(下板，上板为412c对照)。
图A、图C中, M指核酸电泳条带与其大小的标准参照物。![]()
图 5 临床变异链球菌412c基因缺陷菌株与其亲本菌株的产酸、耐酸试验结果
菌株产酸试验结果(与亲本菌株比较, *P < 0.05, **P < 0.01); B: 菌株耐酸试验结果。
表 1 实验所用引物及其序列
引物名称 引物序列(5′-3′) 片段大小 gtfB-PCR 正向: AACTACACTTTCgggTggCTTggTT 525 bp 反向: gATgTATCAgTATAAgCgCCAgTTTCAT hit-PCR 正向: CATgACgTTTCTTTCTAACTTTgATAT 550 bp 反向: gTTTgTAATACATCTgATAAAGACCggCT 1 413 bp 
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表 2 临床变异链球菌株生化反应结果
菌种 甘露醇 山梨醇 棉子糖 蜜二糖 七叶苷 精氨酸 过氧化氢 临床分离菌株 + + + - + - - 模式菌株ATCC 25175 + + + + + - - 灭菌生理盐水 - - - - - + -
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