Pathogenic mechanism of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 protein ORF3a and ORF3b
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摘要:目的
探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的非结构蛋白ORF3a、ORF3b在宿主细胞中的功能。
方法采用细胞免疫荧光法检测SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放量，采用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印迹法(Western blot)检测ORF3a、ORF3b对β干扰素(IFN-β)和炎症因子表达的影响，采用Western blot检测ORF3a、ORF3b对干扰素信号通路中蛋白表达的影响。
结果荧光显微镜观察结果显示，经SARS-CoV-2假病毒感染的过表达血管紧张素转化酶2(ACE2)的A549细胞(A549-ACE2)中，转染ORF3a表达载体、 ORF3b 表达载体的A549-ACE2细胞组装和释放出的SARS-CoV-2假病毒颗粒量均高于未转染和空载转染的A549-ACE2细胞，差异有统计学意义(P < 0.001), 说明ORF3a和ORF3b可促进SARS-CoV-2假病毒颗粒的组装和释放; 给予ploy(I ∶ C)刺激并转染 ORF3a或ORF3b 表达载体的A549细胞，其IFN-β相对表达量低于单纯给予ploy(I ∶ C)刺激的A549细胞，差异有统计学意义(P < 0.001), 说明ORF3a、ORF3b转染表达可显著抑制ploy(I ∶ C)诱导的IFN-β表达水平; Western blot检测结果显示，与单纯给予IFN-β处理相比，给予IFN-β联合ORF3a或ORF3b转染处理能够抑制干扰素信号通路中关键蛋白MyD88、TRAF6的表达水平; 转染 ORF3a 、 ORF3b 表达载体的A549细胞中炎症因子(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6)相对表达量均高于空载转染的A549细胞，差异有统计学意义(P < 0.01或P < 0.001)。
结论非结构蛋白ORF3能够促进SARS-CoV-2组装和释放，诱导宿主炎症应答，并抑制宿主干扰素表达。
Abstract:ObjectiveTo investigate functions of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) non-structural protein ORF3a and ORF3b in host cells.
MethodsThe assembly and release of SARS-CoV-2 pseudovirus were detected by immunofluorescence assay; real-time polymerase chain reaction and western blot were used to detect the effects of ORF3a and ORF3b on expression of IFN-β and inflammatory factors. Western blot was used to detect the effects of ORF3a and ORF3b on protein expression in interferon signaling pathway.
ResultsFluorescence microscopic results showed that the number of packaged and released pseudovirus particles in human lung cell line A549 [A549-angiotensin converting enzyme 2 (ACE2)]cells overexpressing ACE2 infected by SARA-COV-2 pseudovirus and transfected ORF3a expression vector and ORF3b expression vector was higher than those of untreated cells and empty vector cells, indicating that ORF3a and ORF3b could promote the assembly and release of SARA-COV-2 particles; A549 cells were stimulated with ploy (I ∶ C) and then transfected with ORF3a or ORF3b expression plasmid. The expression of IFN-β in above cells was significantly lower than that single ploy (I ∶ C) stimulated A549cells(P < 0.001), indicating that the transfected expression of ORF3a and ORF3b could significantly inhibit IFN-β expression in cells induced by ploy (I ∶ C). Western blot assay showed that the expressions of key proteins such as MyD88 and TRAF6 in interferon signaling pathway were inhibited after cells dealing with IFN-β and transfected with ORF3a or ORF3b as compared with treated by IFN-β cells alone; inflammatory cytokines levels such as (tumor necrosis factor-α, interleukin-1β, interleukin-6) in A549 cells transfected with ORF3a or ORF3b expression vector were significantly increased in ORF3a or ORF3b expression host cells compared with the empty vector A549 cells(P < 0.01 or P < 0.001).
ConclusionNon-structural protein ORF3 can promote viral assembly and release of SARS-CoV-2, induce host inflammatory response, and inhibit host interferon expression.
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Keywords:
- novel coronavirus /
- non-structural protein /
- ORF3a /
- ORF3b /
- interferon /
- inflammatory factors
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支气管肺发育不良(BPD)是新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)的并发症之一，且早产儿胎龄越低, BPD发病率越高，给其家庭及社会带来了沉重负担[1-2]。目前, BPD的鉴别诊断依据以动脉血气分析结果为主，但多次动脉采血不仅增加患儿不适感，而且无法连续监测，极易影响诊断准确性[3]。无创经皮血气分析具有无创、持续动态监测、并发症少等特点，可动态反映经皮氧分压[ptc(O2)]、经皮二氧化碳分压[ptc(CO2)]变化情况，为临床诊治提供参考依据[4]。相关研究[5]表明，炎症反应在BPD的发生中发挥重要作用。白细胞介素-6(IL-6)是经典促炎因子之一，可介导机体炎症反应，加剧肺损伤。淀粉样蛋白A(SAA)是一种感染急相蛋白，其水平升高提示机体存在感染，已被用于小儿肺部疾病的鉴别诊断中[6-7]。本研究探讨ptc(O2)、ptc(CO2)及血清SAA、IL-6水平对NRDS患儿并发BPD的预测价值，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2021年2月—2023年2月衡水市第二人民医院收治的240例NRDS患儿作为研究对象。纳入标准: ①符合NRDS诊断标准[8](早产儿，出生6 h内出现进行性呼吸困难，胸片可见双侧肺透明膜肺野亮度降低，内部可见网状阴影，支气管见充气征，血气分析示低氧血症)者; ②其监护人知晓本研究并签署同意书者。排除标准: ①先天性呼吸系统发育畸形者; ②神经系统畸形者; ③临床资料缺失，影响判断者; ④合并严重先天性心脏病者; ⑤中途退出(死亡、放弃治疗、转院)者。根据是否并发BPD, 将NRDS患儿分为BPD组108例和非BPD组132例。2组患儿一般资料(性别、胎龄、出生体质量、宫内窘迫、宫内感染、胎膜早破)比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表 1。本研究经医院医学伦理委员会审核批准[批件号：院科伦审(2020)伦审第(000085)号]。
表 1 2组患儿一般资料比较(x±s)[n(%)]组别 n 性别 胎龄/周 出生体质量/g 宫内窘迫 宫内感染 胎膜早破 男 女 BPD组 108 62(57.41) 46(42.59) 32.21±1.43 1 522.24±105.51 20(18.52) 14(12.96) 16(14.81) 非BPD组 132 69(52.27) 63(47.73) 31.95±1.68 1 499.88±110.24 24(18.18) 12(9.09) 14(10.61) t/χ2 0.632 1.274 1.594 0.005 0.922 0.962 P 0.428 0.204 0.112 0.946 0.337 0.327 1.2 方法
① ptc(O2)、ptc(CO2)监测方法: 分别于出生后第1、7、14天，使用丹麦雷度TINA-TCAM经皮氧分压仪、经皮二氧化碳分压仪于患儿胸前区或脐周进行监测，先将对应处皮肤消毒、干燥，稳定固定环，注入接触液固定电极，待读数稳定后监测结果，持续监测0.5 h。②血清SAA、IL-6水平检测方法: 分别于出生后第1、7、14天采集患儿2 mL空腹外周肘静脉血，以3 000 r/min速度离心15 min, 取上清液，采用酶联免疫吸附法检测SAA、IL-6水平，操作步骤均参照上海科艾博生物技术有限公司试剂盒说明书。③ BPD诊断标准: 任何氧依赖[吸入氧浓度(FiO2)>21%]超过28 d的新生儿。④病情程度评估标准: BPD程度[9]包括轻度(未用氧)、中度(FiO2 < 30%)、重度(FiO2≥30%或需机械通气)3个等级; 肺功能障碍[10]包括轻度堵塞[达峰时间比(TPTEF/TE) 为23%~27%]、中度堵塞(TPTEF/TE为15%~ < 23%)、重度堵塞(TPTEF/TE为 < 15%)3个等级。出院时使用德国康讯公司生产的肺功能仪进行检测，解开被测患儿上衣领口，清理鼻咽分泌物，待其自然入睡或镇静入睡后，将面罩罩于患儿口鼻，连续测试5次，每次测试潮气呼吸不得低于20次，测试完成后，电脑自动记录TPTEF/TE并计算其平均值。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示, 2组间比较采用独立样本t检验，等级资料采用卡方检验，相关性分析采用Spearman相关分析法，采用相对危险度(RR)和95%置信区间(CI)评价各指标对疾病的影响，通过受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积(AUC)分析预测效能，绘制决策曲线分析临床净获益，检验水准α=0.05, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较
出生后第1天, 2组患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05); 出生后第7、14天, BPD组ptc(O2)低于非BPD组, ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平高于非BPD组，差异有统计学意义(P < 0.05)，见表 2。
表 2 2组患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较(x±s)时点 组别 n ptc(O2)/mmHg ptc(CO2)/mmHg SAA/(mg/L) IL-6/(pg/mL) 出生后第1天 非BPD组 132 49.12±3.86 50.39±4.51 10.96±3.96 21.18±4.35 BPD组 108 48.85±4.33 50.24±4.68 12.08±4.91 20.05±5.51 出生后第7天 非BPD组 132 46.65±4.11 52.21±4.79 15.52±4.48 26.41±5.53 BPD组 108 44.42±3.78* 55.62±5.13* 58.58±6.63* 66.62±7.46* 出生后第14天 非BPD组 132 44.89±3.65 54.17±5.10 22.41±4.68 33.34±4.18 BPD组 108 42.24±3.55* 57.74±5.68* 65.51±7.44* 70.72±8.02* ptc(O2): 动脉血氧分压; ptc(CO2): 动脉血二氧化碳分压; SAA: 淀粉样蛋白A; IL-6: 白细胞介素-6。1 mmHg=0.133 kPa。
与非BPD组比较, * P < 0.05。2.2 不同病情程度患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较
出生后第1天，轻度BPD患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平与中重度BPD患儿比较，差异无统计学意义(P>0.05); 出生后第7、14天，中重度BPD患儿ptc(O2)低于轻度BPD患儿, ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平高于轻度BPD患儿，差异有统计学意义(P < 0.05)。出生后第1天，不同程度肺功能障碍患儿的ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05); 出生后第7、14天，重度堵塞、中度堵塞、轻度堵塞患儿ptc(O2)依次降低, ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平依次升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 3。
表 3 不同病情程度患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平比较(x±s)病情 程度 n 时点 ptc(O2)/mmHg ptc(CO2)/mmHg SAA/(mg/L) IL-6/(pg/mL) BPD 轻度 49 出生后第1天 48.69±4.46 49.59±5.51 11.42±4.89 19.86±2.85 出生后第7天 46.13±4.33 52.38±5.89 48.89±4.43 57.59±5.43 出生后第14天 44.56±3.95 54.28±6.11 55.36±5.87 62.63±6.95 中重度 59 出生后第1天 48.98±3.98 50.78±4.46 12.63±4.66 20.21±1.58 出生后第7天 43.00±5.18* 58.31±6.03* 66.63±5.69* 74.12±6.87* 出生后第14天 40.31±3.02* 60.61±6.45* 73.94±7.24* 77.44±7.74* 肺功能障碍 轻度堵塞 40 出生后第1天 48.86±4.65 50.24±4.77 11.85±1.51 19.67±3.04 出生后第7天 46.95±4.48 52.18±5.53 50.36±5.59 62.55±5.57 出生后第14天 45.36±3.78 53.68±5.60 59.59±6.02 66.48±6.33 中度堵塞 55 出生后第1天 47.94±5.12 49.89±5.24 12.11±1.38 20.53±2.59 出生后第7天 43.51±3.56# 56.94±5.89# 61.64±6.11# 67.74±6.12# 出生后第14天 41.03±3.44# 58.85±5.99# 67.28±6.74# 71.69±6.68# 重度堵塞 13 出生后第1天 49.35±4.03 50.74±4.16 12.66±1.05 20.85±2.26 出生后第7天 40.49±3.12#△ 60.52±6.49#△ 70.93±6.85#△ 74.10±7.53#△ 出生后第14天 37.76±3.05#△ 65.54±6.87#△ 76.24±8.03#△ 79.44±8.12#△ 与同时点轻度比较, * P < 0.05; 与同时点轻度堵塞比较, #P < 0.05; 与同时点中度堵塞比较, △P < 0.05。 鉴于患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平在出生后第7天时变化最明显，本研究选用出生后第7天时ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平进行后续研究。相关性分析结果显示，患儿BPD程度与出生后第7天时ptc(O2)呈负相关(r=-0.724, P < 0.05)，与出生后第7天时ptc(CO2)、SAA、IL-6呈正相关(r=0.635、0.830、0.715, P < 0.05); 患儿肺功能障碍程度与出生后第7天时ptc(O2)呈负相关(r=-0.719, P < 0.05), 与出生后第7天时ptc(CO2)、SAA、IL-6呈正相关(r=0.673、0.756、0.696, P < 0.05)。
2.3 ptc(O2)、ptc(CO2)与SAA、IL-6的相关性分析
相关性分析结果显示，出生后第7天时, BPD患儿ptc(O2)分别与SAA、IL-6呈负相关(r=-0.605、-0.623, P < 0.05), ptc(CO2)分别与SAA、IL-6呈正相关(r=0.618、0.650, P < 0.05)。
2.4 ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6对NRDS患儿并发BPD的预测价值
以NRDS患儿并发BPD为阳性标本，未并发BPD为阴性标本，绘制ROC曲线。分析结果显示，出生后第7天ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6联合预测NRDS患儿并发BPD的效能高于四者单独预测, AUC为0.938(95%CI: 0.899~0.965), 敏感度为92.59%, 特异度为82.58%; ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6单独预测的AUC分别为0.810(95%CI: 0.754~0.857)、0.766(95%CI: 0.708~0.818)、0.825(95%CI: 0.771~0.871)、0.799(95%CI: 0.743~0.848), 当截断值分别为46.13 mmHg、55.96 mmHg、55.92 mg/L、63.83 pg/mL时，敏感度分别为75.00%、75.00%、81.48%、77.78%, 特异度分别为73.48%、69.70%、71.21%、72.73%, 见图 1、表 4。
表 4 ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6单独及联合预测NRDS患儿并发BPD的效能比较成对对比 AUC差异 标准误差 95%CI Z P ptc(O2)对比联合 0.128 0.031 0.068~0.188 4.187 < 0.001 ptc(CO2)对比联合 0.189 0.035 0.120~0.258 5.381 < 0.001 SAA对比联合 0.153 0.035 0.084~0.222 4.354 < 0.001 IL-6对比联合 0.184 0.034 0.117~0.250 5.438 < 0.001 2.5 ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6对NRDS患儿并发BPD的影响
分别根据ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6的截断值将2组患儿划分为高表达者和低表达者。ptc(CO2)、SAA、IL-6高表达者并发BPD的风险是低表达者的2.256、1.668、1.667倍, ptc(O2)高表达者并发BPD的风险是低表达者的0.568倍，见表 5。
表 5 ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6对NRDS患儿并发BPD的影响[n(%)]指标 分类 BPD组(n=108) 非BPD组(n=132) RR(95%CI) U P ptc(O2) 高表达 33(30.56) 71(53.79) 0.568(0.410~0.786) -2.720 < 0.05 低表达 75(69.44) 61(46.21) ptc(CO2) 高表达 81(75.00) 56(42.42) 2.256(1.585~3.210) 3.761 < 0.05 低表达 27(25.00) 76(57.58) SAA 高表达 86(79.63) 63(47.73) 1.668(1.363~2.043) 3.121 < 0.05 低表达 22(20.37) 69(52.27) IL-6 高表达 90(83.33) 66(50.00) 1.667(1.378~2.016) 3.186 < 0.05 低表达 18(16.67) 66(50.00) 2.6 决策曲线分析
当阈值在0.2~0.9时，出生后第7天时ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6联合模型预测NRDS患儿合并BPD的净获益率优于ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6单独预测，见图 2。
3. 讨论
NRDS并发BPD是新生儿科重症监护病房中极为棘手的难题，特征为肺纤维化、肺间质水肿及小气道结构改变，随着时间的推移可发展为永久性肺功能异常，影响患儿的生长发育。目前已有大量关于BPD鉴别诊断的临床研究[11-12], 涉及体液生物标志物、影像学特征、肺功能指标等方面，但尚无高度特异性的诊断指标。
pa(O2)、pa(CO2)是评估BPD患儿肺通气功能的金标准，但其属创伤性操作，多次抽血易引起局部创伤、感染、医源性贫血等并发症，且早产儿体质量低，皮肤薄，采血相对困难[13-14]。经皮血气分析是一种无创性连续血气测定技术，不仅能持续动态监测ptc(O2)、ptc(CO2)，还能减少采血次数，降低疼痛、医源性贫血的发生率[15]。国外研究[16]显示, ptc(O2)、ptc(CO2)分别与pa(O2)、pa(CO2)存在相关性，尤其适用于呼吸功能障碍患儿。本研究发现，出生后第7、14天, BPD组ptc(O2)显著低于非BPD组, ptc(CO2)显著高于非BPD组，这可能是因为BPD患儿气道阻力及呼吸功能发生改变，引起肺泡通气与血流比例失调，气体交换面积减少，进而引起ptc(O2)、ptc(CO2)异常[17]。本研究还发现，随着BPD程度、肺功能障碍严重程度的增加, NRDS并发BPD患儿ptc(O2)逐渐降低，ptc(CO2)逐渐升高，表明ptc(O2)、ptc(CO2)可反映病情严重程度。ROC曲线显示，相较于ptc(CO2), ptc(O2)预测NRDS患儿并发BPD的效能更高，这可能与低出生体质量儿皮肤相对薄弱，气体弥散系数更高有关。
BPD发病机制复杂，涉及宫内因素、遗传易感性、炎症反应等方面[18]。SAA是一种新型炎性标志物，其水平在炎症刺激下迅速上升，并在炎症缓解后迅速恢复正常，动态监测SAA水平有助于炎症性疾病的鉴别诊断及疾病状态评估[19-20]。既往研究[21]证实, SAA在NRDS患儿血清中呈高表达，但其是否参与BPD的发生发展尚未明确。本研究发现，随着时间的推移和病情的进展, NRDS合并BPD患儿血清SAA水平逐渐升高，提示在多种损伤因素持续存在的情况下, BPD患儿肺泡损伤程度逐渐加重，机体代偿反应持续增强，血清SAA水平代偿性增高，肺部炎症反应加重，形成恶性循环。本研究结果显示，出生后第7天患儿机体血清SAA升高最明显，且与BPD程度、肺功能障碍程度的相关性最强，提示出生后第7天时检测SAA水平有助于早期预测BPD。ROC曲线显示，出生后第7天血清SAA预测BPD的AUC为0.825, 有助于临床诊治。
IL-6是一种多功能细胞因子，可通过旁分泌、自分泌形式刺激机体组织细胞，增强细胞外基质活性，参与炎症反应过程[22]。既往研究[23-24]表明, BPD患儿血清IL-6水平显著高于非BPD患儿，且IL-6水平与BPD程度、肺功能障碍程度呈正相关，与本研究结论相符。相较于单纯NRDS, NRDS并发BPD引起的肺部炎症反应更严重，可激活体内特异性和非特异性免疫细胞，合成过量IL-6, 抑制肺泡和肺血管正常发育，加速病情进展[25]。本研究基于3个观察时点发现，随着时间的推移, BPD组/非BPD组、轻度BPD者/中重度BPD者、轻度堵塞者/中度堵塞者/重度堵塞者IL-6水平均呈升高趋势，且以出生后第7天时升高最为明显，说明出生后第7天是NRDS并发BPD患儿炎症反应最严重的时期，考虑与高氧环境、机械通气、肺部反复感染的综合作用有关。本研究结果还显示，出生后第7天IL-6预测NRDS患儿并发BPD的AUC为0.799, 且IL-6高表达者并发BPD的风险是低表达者的1.667倍，故IL-6对NRDS并发BPD具有预测价值。
本研究发现，出生后第7天ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6单一预测NRDS并发BPD的价值有限，但四者联合预测NRDS并发BPD的AUC达0.938, 说明四者联合检测有助于提高预测效能，为临床有效诊治BPD提供参考依据。本研究决策曲线分析结果显示，四者联合预测的净获益率优于ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6单一预测，因此，重点关注ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6水平异常的NRDS患儿，并结合具体情况强化治疗措施，有望预防BPD的发生与发展。
综上所述, NRDS并发BPD患儿ptc(O2)、ptc(CO2)和血清SAA、IL-6水平异常，ptc(O2)、ptc(CO2)、SAA、IL-6均与病情程度密切相关，四者联合检测有助于提高对NRDS并发BPD的预测效能及净获益率。但本研究纳入的患儿来自同一家医院，缺乏多中心数据支持，亦未对存活的NRDS并发BPD患儿进行远期随访，有待未来开展大样本量多中心研究加以验证。
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图 1 SARS-CoV-2假病毒感染A549-ACE2细胞的荧光显微镜下观察与统计
A: 各组A549-ACE2细胞经SARS-CoV-2假病毒感染的荧光显微镜下观察结果(放大100倍); B: 各组GFP阳性细胞情况比较(与Mock组、pFLAG-NC组比较, ***P < 0.001)。
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图 2 ORF3a、ORF3b对宿主细胞干扰素应答的影响
A: 各组细胞IFN-β相对表达量比较(组间比较, * * * P < 0.001); B: 各组干扰素信号通路蛋白表达量的Western blot检测结果。
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