Research progress of detection technology for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
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摘要:
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的出现导致了新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的大流行, 快速而准确的实验室诊断对预防COVID-19的传播具有重要的作用。在获得完整的病毒基因组序列的基础上，中国开发了基于聚合酶链反应(PCR)技术的检测手段。此外，大多数患者可被检测到针对SARS-CoV-2的免疫球蛋白G、免疫球蛋白M和免疫球蛋白A的特异性抗体，为血清学检测技术的研发奠定了理论基础。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术是目前SARS-CoV-2的主要检测手段，具有特异性高、检测结果可靠等优势，但对设备和操作者有着较高的要求。本研究对目前SARS-CoV-2检测方法的研究进展进行综述，以期为临床医生及科研工作者提供参考。
Abstract:The emergence of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) led to the pandemic of coronavirus disease 2019 (COVID-19), and rapid and accurate laboratory diagnosis played an important role in preventing the epidemic spreading of COVID-19. On the basis of obtaining the complete virus genome sequence, China developed a detection method based on polymerase chain reaction (PCR). In addition, specific antibodies against SARS-CoV-2 such as immunoglobulin G, immunoglobulin M and immunoglobulin A could be detected in most patients, which lay a theoretical foundation for the research and development of serological detection technology. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) is the main detection method for SARS-CoV-2, which has the advantages of high specificity and reliable detection results, but it has high requirements for equipment and operators. This study reviewed the research progress of SARS-CoV-2 detection methods in order to provide reference for clinicians and researchers.
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新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的迅速传播导致了新型冠状病毒肺炎(COVID-19)在全球范围内的大流行。因此，开发快速而高特异性的病毒检测方法以便快速识别和隔离感染患者对控制SARS-CoV-2的传播至关重要，是全球疫情防控的关键。目前，检测SARS-CoV-2感染的方法包括病原学检测、核酸检测和血清学检测。核酸检测，尤其是实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测方法具有诸多优势，是目前检测SARS-CoV-2感染的首选方法。血清学检测方法主要针对血液中病毒的特异性抗体进行检测，与核酸检测有着较好的互补性。本研究对目前SARS-CoV-2检测方法的研究进展进行综述，以期为临床医生及科研工作者提供参考。
1. 病原学检测
病原学检测是直接检测机体内病毒感染情况的方法，是检测SARS-CoV-2的金标准。病毒的分离、培养、鉴定及电镜观察是目前主要使用的病原学检测方法。LIU C等[1]使用冷冻电子显微镜首次观察到了SARS-CoV-2经灭活后的真实形貌，病毒颗粒近似球形或中度多形性，刺突向外呈钉子状，病毒体嵌入包膜内; 同时，对融合后尖峰结构的研究则表明了融合后的刺突是柔性的，并且相对于病毒膜具有有限的可变方向。非常关键的收获是捕捉到了病毒即将与细胞发生融合这一重要的中间状态，这为SARS-CoV-2的识别、鉴定和临床相关研究提供了重要的超微影像基础。ZHU N等[2]从3份支气管肺泡灌洗样本中分离获得病毒毒株; 同时，体外培养表明接种人气道上皮细胞96 h后即可观察到细胞病变作用，直到接种后6 d, 在Vero E6和Huh-7细胞系中仍未观察到特异性的细胞病变作用。虽然病原学检测方法是检测SARS-CoV-2的金标准，但与其他检测技术相比，其对实验室环境要求极为苛刻，必须在P3级及以上的实验室内进行，同时操作过程繁琐、耗时且难度高，难以满足现阶段SARS-CoV-2的检测需求，只适用于基础科学研究。
2. 核酸检测
机体感染SARS-CoV-2后会产生大量RNA, 而免疫系统产生的抗体往往出现较晚，因此核酸检测仍是目前最主要的检测方法。核酸检测的主要样本来源包括感染者的鼻咽拭子、深部痰、下呼吸道分泌物、肺泡灌洗液等。
2.1 基因测序技术
随着高通量测序技术(NGS)的迅猛发展，其在病原检测中展现出一定的技术优势，可在第一时间获取新发未知病毒的基因组序列信息，为突发疫情的防控和后续研究提供了技术支撑。NGS可一次性地检测包括SARS-CoV-2在内的所有可能感染的病原微生物基因序列[3], 为获得多重感染或继发感染的相关病原信息提供支持。CHEN L J等[4]利用宏基因组测序(mNGS)快速检测出患者支气管肺泡灌洗液(BALF)标本中的SARS-CoV-2; 进一步的系统发育分析表明, SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒毒株bat-SL-CoVZC45、bat-SL-CoVZXC21具有87.9%的核苷酸同源性。WANG M等[5]结合病毒靶向扩增和纳米孔测序长读、实时的优势，创造性地开发了纳米孔靶向测序(NTS)技术，仅需6~10 h即可同时检测包括SARS-CoV-2等多种常见的呼吸道病毒，有助于快速判断SARS-CoV-2患者是否发生多重感染，对临床诊断及治疗具有重大的意义。同时, NTS还可以检测病毒突变，用于SARS-CoV-2的分型，为流行病学分析提供支持。虽然NGS具有高准确性、高灵敏度等优势，但鉴于其检测仪器昂贵、检测结果需要专业人士来解读、检测周期长等问题，难以进行大规模的快速筛查。
2.2 qRT-PCR技术
qRT-PCR技术是目前临床检测SARS-CoV-2的主要手段。qRT-PCR技术是从样本中分离出病毒RNA, 利用荧光信号对逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的进程进行实时检测，最后通过标准曲线进行定量分析。目前, SARS-CoV-2基因组中的ORF1ab基因和N基因是qRT-PCR的主要靶向。CHU D K W等[6]开发了2种单步qRT-PCR, 用于检测SARS-CoV-2基因组中的ORF1ab基因和N基因，通过对COVID-19患者的临床样本进行进一步系统性研究，证实了该方法在临床诊断中的价值，并发现了N基因RT-PCR检测对临床样本中的SARS-CoV-2 RNA更为敏感，约是ORF1ab基因测定的10倍。依据检测性能, N基因RT-PCR被建议用作筛查测定，而ORF1ab基因测定则推荐作为确诊测定。CORMAN V M等[7]在缺乏SARS-CoV-2分离株的条件下，利用公开的SARS-CoV-2序列，开发了一种针对N、E和RdRP基因的单步RT-PCR试剂盒，其中RdRP基因测定表现出最高的灵敏度。CHAN J F W等[8]开发了针对RdRp/Hel不同区域的新型检测方法，对于不同类型的临床样本均显示出较之前开发的RdRp-P2基因测定法更高的灵敏度。更重要的是, RdRp/Hel检测方法与其他常见呼吸道病原体无交叉反应，具有高度特异度。
尽管qRT-PCR技术具有成本较低、操作简便、快速、高灵敏度和高特异度等特点，但仍有缺点，例如采样方式的不规范以及感染早期时病毒载量低于qRT-PCR检测阈值等均会导致假阴性结果，因而在后续的检测工作中需规范样本采集，多部位联合采集，以减少假阴性结果的发生[9]。
2.3 微流控芯片技术
微流体技术将样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成到微米级芯片中，自动完成整个分析过程。即时检验(POCT)也称为快速现场检验或床头检验，不同于传统的检验模式, POCT是一种在采样现场立即进行分析的新方法，不需要在实验室测试中对标本进行复杂的处理程序，可以快速获得检验结果。微流体技术具有低成本、高通量、快速、易于微型化等优势，被广泛应用于POCT领域。DVBOX(DetectVirus BOX)也称为检毒BOX, 是由中国自主研发的一款全封闭、超高灵敏度的一体式微流控SARS-CoV-2核酸检测POCT设备[10], 具有低实验操作环境要求、高灵敏度、低假阴性率、低检测成本、无需运输样本、检测时间短、不需要大量经专业防护和实验操作培训的技术人员等优势。
2.4 环介导等温扩增技术
RT-PCR因其高灵敏度、高准确度等优势而被广泛用于SARS-CoV-2的检测，但仍然存在一定的局限，例如对温控精度高的热循环仪的依赖而导致检测时间较长，因而无法实时快速地检测SARS-CoV-2。环介导等温扩增技术(LAMP)可在等温条件下快速、高效地扩增，非常适合SARS-CoV-2核酸的现场快速检测。LAMP是一种新型的核酸扩增方法，在引物和链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下, 60~65 ℃恒温扩增, 15~60 min即可实现109~1010倍的核酸扩增，一般针对靶基因的6个区域设计4~6种特异引物以提高特异性，具有操作简便、特异性强、产物易检测等优点，可广泛用于感染性疾病的检测。
HONG T C T等[11]基于LAMP技术开发了一种单步单管加速实时定量RT-LAMP测定法，对临床49份标本检测, RT-LAMP分析的检测灵敏度是RT-PCR的100倍，检测极限为0.01 PFU。ANAHTAR M N等[12]利用RT-LAMP对135例鼻咽标本进行了COVID-19感染评估，通过优化样本, RT-LAMP可利用有限的设备实现快速且准确的SARS-CoV-2检测，有成为理想检测方法的潜力，尤其是在资源有限的环境下。LAMB L E等[13]确定了RT-LAMP的最佳条件: 63 ℃温育30 min。YU L等[14]基于LAMP技术进行优化，开发了iLACO快速检测技术，该技术以ORF1ab基因为检测靶区进行LAMP等温扩增，灵敏度与基于Taq酶的RT-PCR相当，同时可以利用测序比对区分SARS-CoV-2与其他病毒，确保了检测的特异性。
RT-LAMP具有操作简单、快速高效、检测灵敏、特异性高等优势，可用于快速筛查，但极易污染而产生假阳性结果，故要特别注意严谨操作。此外, RT-LAMP目前使用的引物组的灵敏度不足以充分检测出低病毒载量人群的感染[10]。RT-LAMP技术若在产物的回收鉴定、克隆、单链分离等方面加以完善和改进，对检测性能的提高有着积极的意义[15]。
3. 血清学检测
目前, RT-PCR检测阳性是公认的诊断临床疑似病例的确诊标准。然而, RT-PCR检测结果的准确性很大程度上依赖于病毒载量，低病毒载量易出现假阴性结果。血清学检测操作便捷、耗时少，可以作为核酸检测的有益补充，辅助临床诊断[16]。同时，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》[17]明确将SARS-CoV-2特异性抗体检测纳入确诊病例的诊断标准以及疑似病例的排除标准。感染SARS-CoV-2后，免疫球蛋白M(IgM)最早可在感染后的第3天被检测到，其峰值出现在感染后2~3周; 免疫球蛋白G(IgG)最早可在4 d内出现，并在17 d内达到峰值[18]。血清学检测方法主要包括胶体金法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和化学发光免疫分析(CLIA), 具有灵敏度高、简便、范围广、易推广等优点。
3.1 胶体金法
胶体金法是一种以胶体金作为示踪标志物检验抗原抗体的免疫标记检测技术，无需专业、昂贵的设备和试剂，具有操作简单、结果迅速等优点，被广泛应用于病原体检测领域。
邓杰伦等[19]对76例患者血清IgM和总抗体进行了胶体金检测，特异性均>90%, 阳性预测值和阴性预测值均>70%, 可以满足临床要求，辅助临床诊断。LI Z T等[20]基于免疫胶体金技术的原理，创新地研发了IgM-IgG联合抗体快速检测方法，可以在15 min内确认近期是否有SARS-CoV-2感染。彭孝斌等[21]分别采用ELISA与胶体金法对26例确诊病例和54例发热患者进行IgM及IgG检测，结果表明，在现有的试剂条件下，胶体金法较ELISA操作更为简便、快捷，更适合基层实验室。
胶体金法多以静脉血和指尖血为检测样本，易于获取，短时间内即可得到检测结果，因而适用于大规模人群筛查。但由于较低的灵敏度和较长的检测窗口期，胶体金法尚不能作为SARS-CoV-2确诊和排除的唯一依据[20]。
3.2 CLIA
CLIA是一种具有化学发光测定技术的高灵敏度与免疫反应的高特异度新型检测分析技术，其原理是以磁微粒作为固相载体，通过对化学发光强度的检测来确定待测物浓度。CLIA的主要优势有: ①样本易于获得; ②具有快速高效，灵敏度高，可实现对样本全自动、高通量检测等优势。但是, CLIA也存在一系列问题，如抗体检测窗口期长、假阳性率高等。
重庆医科大学联合博奥赛斯生物科技有限公司研发的SARS-CoV-2化学发光免疫检测试剂盒是全球首批获批的磁微粒化学发光SARS-CoV-2 IgG/IgM检测试剂盒，已累计完成13 532例样本测试，其中1 362例为COVID-19确诊病例，结果显示IgM灵敏性为93.7%, 特异性为99.4%, IgG灵敏性为89.6%, 特异性为99.2%。廖凡路等[22]发现部分确诊患者SARS-CoV-2核酸检测始终为阴性，而SARS-CoV-2抗体的检测，尤其是总抗体对其敏感性很高(总抗体检测阳性率为100%), 表明增加SARS-CoV-2抗体的检测对于临床确诊患者的诊断有十分重要的意义。数据分析[23]表明，化学发光抗体检测试剂仍不能取代RT-PCR确诊检测，且需要专业的化学发光检测设备，也不适用于人群筛查。
3.3 ELISA
ELISA是目前最常用的免疫分析方法，其原理是利用抗原、抗体间专一性键结合的特性进行检测。由于结合于聚苯乙烯载体上的SARS-CoV-2抗原仍具有免疫活性，配合酶促呈色反应，即可显示人血清中是否存在SARS-CoV-2抗体，并可根据呈色的深浅进行定量分析。
胡燕等[24]利用ELISA分别对116例COVID-19患者和346例非COVID-19者的血清SARS-CoV-2抗体进行检测, ELISA检测血清SARS-CoV-2 IgG抗体的敏感性为63.79%, 特异性为96.53%, 准确性为88.31%; ELISA检测血清SARS-CoV-2 IgM抗体的敏感性为58.62%, 特异性为97.40%, 准确性为87.66%, 可以满足实验室检测需要。
ELISA的灵敏度高、特异度高、检测成本低，但是操作较为繁琐，在抗体检测的窗口期以及感染初期难以获得准确的检测结果，使得ELISA只能作为SARS-CoV-2核酸检测阴性疑似病例的补充检测手段。
4. 总结与展望
目前，核酸检测仍是SARS-CoV-2主流的早期检测手段，对SARS-CoV-2的传播起着重要的预防作用。但是，目前的核酸检测方法也存在一些局限性，包括检测灵敏度低、检测时间长、对实验环境和人员要求高、在临床应用中容易出现假阴性结果等。相比较而言，血清学检测操作便捷、耗时少，但机体对SARS-CoV-2的免疫反应导致血清学检测无法对COVID-19患者进行早期即时筛查，因此建议将核酸检测与血清学检测结合使用以提高COVID-19的检测精度。此外，影像学检查也是COVID-19的重要检测手段，联合应用可提供更加可靠的诊断结果[25]。
目前，疫情防控重点在于对无症状感染者进行有效监测，技术创新就显得极为重要，提高灵敏度和准确度、高通量检测、自动化、便携等是目前新技术开发的主要方向。随着上述新技术的发展，对COVID-19患者的检测和诊断能力将进一步提高。
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