Expression and significance of Caspase-1, Gasdermin D and N-terminal fragment of GSDMD in serum and lesions of patients with psoriasis vulgaris
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摘要:目的
检测寻常型银屑病患者血清半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)及皮损Caspase-1、Gasdermin家族蛋白D(GSDMD)、Gasdermin家族蛋白D-N端(GSDMD-N)的表达水平, 进一步探索细胞焦亡在银屑病中的作用。
方法将进行期寻常型银屑病的30例患者纳入银屑病组(PSO组)，收集30例患者的血清样本和其中20例患者的皮损样本，并收集同时期在苏北人民医院体检中心体检的30例健康者的血清和整形外科20例健康求美者的皮肤组织(皮损)纳入健康对照组(CON组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法(qRT-PCR)检测2组血清Caspase-1 mRNA的表达水平; 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测2组血清Caspase-1的含量; 采用蛋白免疫印迹法检测2组皮肤组织中Caspase-1蛋白的表达水平; 采用免疫组织化学(IHC)法检测2组皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N的表达及分布情况。
结果PSO组患者血清中Caspase-1 mRNA表达水平高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组血清中Caspase-1蛋白表达水平为(1 047.74±276.20) pg/mL, 高于CON组的(371.20±160.84) pg/mL, 差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组与CON组的Caspase-1总体蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05); PSO组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白表达水平低于CON组, Cleaved Caspase-1蛋白表达水平和GSDMD蛋白表达阳性率高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01)。PSO组皮损中GSDMD-N蛋白表达阳性率高于CON组，差异有统计学意义(P<0.01)。
结论进行期寻常型银屑病患者血清及皮损中Caspase-1和皮损中GSDMD、GSDMD-N表达增加，提示细胞焦亡通路可能参与寻常型银屑病的发生和发展。
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关键词:
- 银屑病 /
- 细胞焦亡 /
- 半胱氨酸蛋白酶-1 /
- Gasdermin家族蛋白D /
- Gasdermin家族蛋白D-N端
Abstract:ObjectiveTo detect the expressions of Caspase-1 in serum and Caspase-1, Gasdermin D (GSDMD) as well as N-terminal fragment of GSDMD(GSDMD-N) in lesions of patients with psoriasis vulgaris, and further explore the role of pyroptosis in psoriasis.
MethodsA total of 30 patients with progressive psoriasis vulgaris were enrolled into psoriasis group (PSO group). Serum samples from 30 healthy subjects who underwent physical examinations in the Physical Examination Center of Northern Jiangsu People's Hospital and skin tissue (skin lesions) from 20 healthy aesthetic seekers in Department of Plastic Surgery were collected and included in healthy control group (CON group). The expression of Caspase-1 mRNA in the serum was detected by Quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR); the levels of serum Caspase-1 of two groups were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA); the expression of proteins of Caspase-1 in samples of skin tissues were detected by western blot; the expression and distribution of GSDMD and GSDMD-N in samples of skin tissues were detected by immunohistochemical method(IHC).
ResultsThe expression level of Caspase-1 mRNA in serum of the PSO group was significantly higher than that of in the CON group (P<0.01). The level of serum Caspase-1 protein expression in the PSO group was (1 047.74±276.20) pg/mL, which was significantly higher than (371.20±160.84) pg/mL in the CON group (P<0.01). The expression level of total Caspase-1 protein between PSO group and CON group showed no significant difference(P>0.05). The expression level of Pro-Caspase-1 protein in skin lesions of the PSO group was significantly lower than that in the CON group, and the positive rates of expression of Cleaved Caspase-1 protein and GSDMD protein of the PSO group were significantly higher than those in the CON group (P<0.01). The positive rates of expression of GSDMD-N protein in skin lesions of the PSO group was significantly higher than that in the CON group (P<0.01).
ConclusionThe expressions of Caspase-1 in serum and skin lesions, GSDMD and GSDMD-N in skin lesions are increased in patients with psoriasis vulgaris in active stage, suggesting that the pyroptosis pathway may be involved in the occurrence and development of psoriasis vulgaris.
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Keywords:
- psoriasis /
- pyroptosis /
- Caspase-1 /
- Gasdermin D /
- N-terminal fragment of GSDMD
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肺结节是指影像学表现为局灶性、类圆形、密度增大、直径≤3 cm且周围被含气肺组织包绕的实性或亚实性肺部阴影，而肺癌在早期常表现为肺结节。尽早鉴别诊断肺结节良恶性，对于改善治疗效果和预后具有重要意义[1-2]。目前，组织病理学检查依然是诊断非小细胞肺癌(NSCLC)的金标准，但其具有创伤性，且对较小肿瘤组织的操作难度较大，影像学检查则可了解肺癌的部位及大小，但对小结节的敏感度有限。循环游离DNA(cfDNA)是指循环血中游离于细胞外的高度片段化DNA, 源于正常细胞或肿瘤细胞，在卵巢癌、甲状腺癌等多种肿瘤中水平升高，可用于肿瘤的筛查和诊断[3-4]。癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白19片段抗原21-1(Cyfra21-1)是肿瘤标志物，在肺癌患者血清中水平明显升高，常被用于肿瘤诊断[5-6]。既往已有研究[7]将cfDNA浓度和cfDNA完整性用于区分恶性肿瘤患者和健康人群，但其辅助诊断肺结节良恶性的价值尚有待进一步研究。本研究以病理结果为金标准，探讨血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1检测对肺结节良恶性的诊断价值，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年7月—2020年10月在南通市肿瘤医院就诊的110例良恶性肺结节患者作为研究对象，其中男68例，女42例，年龄22~78岁，平均(48.30±8.10)岁，良性肺结节60例，恶性肺结节50例(肺腺癌31例、鳞癌19例)。纳入标准: ①经CT诊断为肺结节，且经病理学确诊者; ②血液采集前未接受手术、放化疗等抗肿瘤治疗者; ③临床资料完整者。排除标准: ①严重心、肝、肾功能不全者; ②伴有其他类型恶性肿瘤或肿瘤转移和复发者。另选取同期健康体检人员30例设为对照组，其中男21例，女9例，年龄22~75岁，平均(47.80±8.30)岁。各组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经南通市肿瘤医院伦理委员会审核批准(批准文号2018-039), 且患者签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 样品采集及保存
采集所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL, 装入抗凝管中，于室温条件下静置30 min, 以3 000转/min离心10 min后收集血浆，置于无菌EP冻存管中, -80 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测cfDNA水平
使用cfDNA快速提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取血浆中总cfDNA, 试剂盒购自德国Qiagen公司，使用核酸定量仪测定波长260 nm与280 nm处的光密度比值(OD260 nm/OD 280 nm), 将OD260 nm/OD 280 nm为1.6~1.8的样本于-20 ℃保存备用。采用qRT-PCR检测各研究对象血浆cfDNA水平，以ALU115基因(115 bp)表示cfDNA浓度，以ALU247基因/ALU115基因表示cfDNA的完整性。ALU115引物扩增的基因包含所有的cfDNA片段(细胞凋亡途径与非凋亡途径), ALU247引物扩增的基因为非凋亡途径释放的cfDNA片段, cfDNA完整性接近1, 表示cfDNA来自于非细胞凋亡途径。ALU115及ALU247引物序列见表 1, 引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。qRT-PCR总体系为20 μL, 循环参数为95 ℃预变性30 s, 95 ℃变性15 s, 65 ℃退火30 s, 72 ℃延伸10 s, 共38个循环，扩增后检测光密度值。以人类基因组DNA为标准品(美国Promega公司)绘制扩增曲线，其中标准曲线回归方程为Y=-3.186logX+39.87, 线性关系良好(R2=1), 根据标准曲线对cfDNA含量及熔解曲线进行分析。
表 1 qRT-PCR引物序列基因 上游引物5′-3′ 下游引物5′-3′ ALU115 CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG CCCGAGTAGCTGGGATTACA ALU247 GTGGCTCACGCCTGTAATC CAGGCTGGAGTGCAGTGG 1.2.3 检测血浆CEA、Cyfra21-1水平
采用化学发光法检测血浆CEA、Cyfra21-1水平, CEA、CYFRA21-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自罗氏公司，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，不符合正态分布的计量资料采用[M(P25, P75)]描述，组间比较采用非参数检验，绘制受试者工作特征(ROC)曲线，分析血浆cfDNA水平及完整性、CEA、Cyfra21-1对恶性肺结节的诊断价值, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性比较
恶性肺结节组患者血浆cfDNA水平、cfDNA完整性均高于良性肺结节组、对照组，差异有统计学意义(P < 0.001); 良性肺结节组血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.113、0.067)。见表 2。
表 2 3组血浆cfDNA水平、cfDNA完整性比较[M(P25, P75)]组别 n cfDNA/(ng/mL) cfDNA完整性 对照组 30 265.23(80.52, 475.34)*** 0.23(0.15, 0.32)*** 良性肺结节组 60 385.43(176.45, 704.55)*** 0.37(0.26, 0.59)*** 恶性肺结节组 50 1 154.83(452.85, 1 642.31) 0.68(0.47, 0.91) 与恶性肺结节组比较, ***P < 0.001。 2.2 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者临床病理特征的相关性
血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者性别、年龄、是否吸烟、肿瘤直径、病理类型、TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移均无相关性(P>0.05), 见表 3。
表 3 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性与恶性肺结节患者临床病理特征的相关性[M(P25, P75)]特征 分类 n cfDNA/(ng/mL) Z P cfDNA完整性 Z P 性别 男 30 1 054.62(405.38, 1 621.22) 1.054 0.310 0.61(0.43, 0.89) 1.198 0.274 女 20 1 108.45(434.21, 1 637.26) 0.71(0.45, 0.93) 年龄 < 50岁 28 1 035.54(396.85, 1 630.51) 2.134 0.135 0.65(0.43, 0.92) 2.025 0.183 ≥50岁 22 1 115.33(426.32, 1 658.45) 0.70(0.41, 0.90) 吸烟 是 18 1 149.55(401.21, 1 639.76) 2.987 0.072 0.67(0.39, 0.87) 1.268 0.260 否 32 1 018.53(453.66, 1 641.72) 0.63(0.42, 0.95) 肿瘤直径 < 4 cm 26 1 035.82(401.52, 1 602.42) 0.373 0.564 0.66(0.38, 0.87) 3.344 0.067 ≥4 cm 24 1 094.47(442.53, 1 640.65) 0.69(0.41, 0.95) 病理类型 腺癌 31 956.42(395.33, 1 583.22) 1.825 0.177 0.65(0.40, 0.91) 1.035 0.323 鳞癌 19 1 168.32(456.44, 1 655.78) 0.72(0.39, 0.90) TNM分期 Ⅰ~Ⅱ期 23 987.42(401.26, 1 609.58) 0.767 0.305 0.61(0.35, 0.89) 0.451 0.507 Ⅲ~Ⅳ期 27 1 165.28(441.53, 1 654.67) 0.73(0.45, 0.94) 肿瘤分化程度 低、中分化 35 1 092.41(413.46, 1 624.43) 3.153 0.069 0.70(0.44, 0.95) 0.361 0.548 高分化 15 1 123.45(398.56, 1 641.55) 0.64(0.38, 0.89) 淋巴结转移 有 29 1 110.24(473.46, 1 655.31) 1.564 0.201 0.62(0.38, 0.86) 2.856 0.091 无 21 985.36(402.21, 1 593.34) 0.74(0.47, 0.95) 2.3 血浆CEA、Cyfra21-1表达水平比较
恶性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1表达水平均高于良性肺结节组、对照组，差异有统计学意义(P < 0.001); 良性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1水平与对照组比较，差异无统计学意义(P=0.073、0.095)。见表 4。
表 4 3组血浆CEA、Cyfra21-1水平比较[M(P25, P75)]ng/mL 组别 n CEA Cyfra21-1 对照组 30 1.78(0.52, 3.45)*** 1.69(0.22, 2.35)*** 良性肺结节组 60 2.67(1.36, 5.45)*** 2.74(1.43, 3.96)*** 恶性肺结节组 50 7.93(3.21, 10.31) 5.75(2.85, 8.12) CEA: 癌胚抗原; Cyfra21-1: 细胞角蛋白19片段抗原21-1。
与恶性肺结节组比较, ***P < 0.001。2.4 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节的诊断效能
ROC曲线分析结果显示，血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节均具有一定的诊断价值，但敏感度与特异度较低; 血浆cfDNA水平、cfDNA完整性诊断恶性肺结节的曲线下面积、敏感度、特异度均大于或高于CEA、Cyfra21-1; 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者联合诊断恶性肺结节的敏感度、特异度均高于四者单独检测，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 5、图 1。
表 5 血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性对恶性肺结节的诊断效能指标 曲线下面积 95%CI 临界值 敏感度/% 特异度/% cfDNA 0.839 0.765~0.872 687.23 ng/mL 85.92* 74.21* cfDNA完整性 0.842 0.787~0.897 0.69 81.82* 72.34* CEA 0.783 0.715~0.851 7.65 ng/mL 79.12* 70.45* Cyfra21-1 0.795 0.724~0.843 6.93 ng/mL 76.92* 71.61* 联合诊断 0.942 0.906~0.975 — 92.34 95.56 与联合诊断比较, *P < 0.05。 3. 讨论
NSCLC约占肺癌的80%, 早期症状不明显或缺乏特异症状，多数患者确诊时已处于疾病中晚期, 5年生存率仅16%~18%, 是癌症相关死亡的首要原因。因此，寻找稳定可靠的早期诊断生物标志物对早期诊治NSCLC和提高患者生存率具有重要意义[8-9]。
cfDNA是一种游离DNA, 可来源于人体凋亡或坏死的正常细胞，也可来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞。研究[10-11]表明，肿瘤患者血浆中cfDNA水平显著高于健康人，且cfDNA在肿瘤良恶性的鉴别诊断中具有重要意义。另有研究[12]发现，与健康者相比, NSCLC患者的血浆游离DNA水平显著升高，提示该指标水平在NSCLC早期诊断中具有一定的临床价值。王宇轩等[13]发现, cfDNA在NSCLC患者血浆中的表达水平显著高于肺部良性结节患者，对肺结节良恶性具有一定的诊断价值。本研究结果亦显示，与良性肺结节组比较，恶性肺结节组患者血浆cfDNA水平、cfDNA完整性均显著升高，其原因可能是在肺结节恶性进展过程中，局部组织供血不足，引起细胞坏死或凋亡, DNA释放，造成血浆cfDNA水平升高。SOLIMAN S E S等[14]研究表明, NSCLC患者血清cfDNA水平与NSCLC分期和转移有关，且血浆血清cfDNA水平和完整性指数在NSCLC早期诊断和预后预测方面具有一定价值。与此不同的是，本研究结果显示, cfDNA水平和cfDNA完整性与临床病理特征无相关性，这可能与本研究样本量较少有关。本研究ROC曲线分析结果显示，血浆cfDNA水平、cfDNA完整性诊断恶性肺结节的曲线下面积、敏感度、特异度均大于或高于CEA、Cyfra21-1, 提示cfDNA水平和cfDNA完整性对恶性肺结节具有一定的诊断价值，但特异度与敏感度均不高。研究[15]显示，血浆cfDNA联合血清标志物可提高对早期胃癌的诊断灵敏度。
CEA为临床常见的肿瘤标志物，在乳腺癌、结肠癌、宫颈癌等多种肿瘤患者中表达水平升高，可用于良恶性肿瘤的诊断；此外, CEA在恶性肺结节患者血清中表达水平升高，为孤立性肺结节的鉴别标志物[16-17]。Cyfra21-1是一种上皮来源性质的新肿瘤标志物，主要表达于肺组织，肺部发生癌变时，其被释放至血液中，故肺癌患者血清Cyfra21-1水平较高[18]。Cyfra21-1是肺癌的肿瘤标志物之一，且对肺结节良恶性具有一定诊断价值，但需要与其他血清标志物联合应用以提高诊断效率[19]。范伟等[20]研究表明, NSCLC患者血清CEA、Cyfra21-1水平显著升高，两者联合检测对NSCLC具有较高的诊断效能。本研究结果显示，恶性肺结节组患者血浆CEA、Cyfra21-1水平显著高于对照组与良性肺结节组，良性肺结节组血浆CEA、Cyfra21-1水平与对照组无显著差异，其可能原因是CEA为糖蛋白，是细胞膜的结构蛋白, Cyfra21-1为上皮细胞结构蛋白亚单位，在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞降解，使大量蛋白被释放至血液中, Cyfra21-1水平升高。本研究进一步分析CEA、Cyfra21-1对恶性肺结节的诊断价值，结果显示两者的敏感度、特异度均不高，但血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性四者联合诊断恶性肺结节的敏感度、特异度显著高于四者单独检测，提示四者联合检测对恶性肺结节具有较高的诊断效能，在肺结节良恶性的鉴别诊断中具有一定临床价值。但本研究样本量较少，未来还需扩大样本量进一步研究cfDNA对肺结节良恶性的鉴别诊断价值。
综上所述，恶性肺结节患者血浆cfDNA、CEA、Cyfra21-1水平和cfDNA完整性均高于良性肺结节患者，血浆cfDNA水平和cfDNA完整性对恶性肺结节具有一定的诊断价值，可作为肺结节良恶性辅助诊断的分子生物学指标。
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图 1 2组皮损中Caspase-1、Pro-Caspase-1和Cleaved Caspase-1蛋白表达水平
A: PSO组和对照组皮损的WB电泳图; B: 2组皮损中的Pro-Caspase-1蛋白含量; C: 2组皮损中的Cleaved-Caspase-1蛋白含量; D: 2组皮损中的Caspase-1总蛋白含量。
与CON组比较, **P<0.01。![]()
图 2 银屑病患者及对照组皮肤组织中GSDMD、GSDMD-N的表达(免疫组织化学染色)
A: 银屑病患者皮损的GSDMD染色结果(放大100倍); B: 银屑病患者皮损的GSDMD染色结果(放大400倍); C: 对照组皮肤组织的GSDMD染色结果(放大100倍); D: 对照组皮肤组织的GSDMD染色结果(放大400倍); E: 银屑病患者皮损的GSDMD-N染色结果(放大100倍); F: 银屑病患者皮损的GSDMD-N染色结果(放大400倍); G: 对照组皮肤组织的GSDMD-N染色结果(放大100倍); H: 对照组皮肤组织的GSDMD-N染色结果(放大400倍)。
表 1 qRT-PCR引物设计序列
引物 上游序列(5′→3′) 下游序列(5′→3′) Caspase-1 ATGGACAAGTCAAGCCGCACAC GATGTCAACCTCAGCTCCAGTTCTTC GAPDH CATCACTGCCACCCAGAAGACTG ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG 
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表 2 2组血清中 Caspase-1 mRNA相对表达量和Caspase-1蛋白表达水平比较(x±s)
组别 Caspase-1 mRNA Caspase-1/(pg/mL) PSO组 1.75±0.63** 1047.74±276.20** CON组 0.50±0.31 371.20±160.84 Caspase-1:半胱氨酸蛋白酶-1。与CON组比较, * * P<0.01。
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