Osteogenic differentiation potential of adipose stem cells transfected with human β-defensin 3 and its effect on anti-periodontitis pathogens
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摘要:目的
探讨人β-防御素3(hβD-3)转染脂肪干细胞(ADSCs)成骨分化潜能及体外抗牙周炎致病菌的作用。
方法体外提取人腹部脂肪组织，分离后用流式细胞仪鉴定人脂肪干细胞(hADSCs)免疫表型(CD29/CD44), 体外培养hADSCs, 将细胞分为对照组、空载组与实验组(按hβD-3-hADSCs接种密度分为低密度组、中密度组和高密度组)，对照组不作处理，空载组转染不含hβD-3基因的慢病毒载体，实验组利用质粒构建含hβD-3基因的慢病毒载体并转染hADSCs。空载组与实验组均加入成骨分化诱导液，对照组不作处理，在诱导7、14 d后，应用实时荧光定量聚合酶链反应检测3组细胞中成骨相关基因[碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ-型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)]的表达量，以评价hADSCs的分化能力。测量抑菌圈的直径，设置抗生素阳性对照(米诺环素组、环丙沙星组)，检测转染后的hADSCs对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌的抑菌活性。
结果诱导7、14 d时，空载组与实验组的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05); 空载组与实验组诱导14 d时的ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量高于诱导7 d时，差异有统计学意义(P < 0.05)。葡萄球菌抑菌实验中，低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组，中密度组抑菌圈大于环丙沙星组，高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组，差异有统计学意义(P < 0.05)。卟啉单胞菌抑菌实验中，低密度组抑菌圈小于米诺环素组与环丙沙星组，中密度组抑菌圈大于米诺环素组，高密度组抑菌圈大于米诺环素组与环丙沙星组，差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论hβD-3转染可促进hADSCs成骨分化，且对牙周致病菌葡萄球菌、卟啉单胞菌均有较好的抗菌活性。
Abstract:ObjectiveTo investigate the osteogenic differentiation potential of human β-defensin 3 (hβD-3) transfected adipose stem cells (ADSCs) and its effect on anti-periodontitis pathogenic in vitro.
MethodsThe human abdominal adipose tissue was extracted in vitro, and the immunophenotype (CD29/CD44) of human adipose stem cells (hADSCs) was identified by flow cytometry after separation. The hADSCs were cultured in vitro, and the cells were divided into control group, no-load group and experimental group. The control group was untreated. The empty group was transfected with a lentiviral vector containing no hβD-3 gene. The experimental group used a plasmid to construct a lentiviral vector containing the hβD-3 gene and was transfected hADSCs. Both the no-load group and the experimental group were added with osteogenic differentiation inducer, and the control group was not treated. The expressions of osteogenic related genes[alkaline phosphatase (ALP), type Ⅰ collagen (Col-Ⅰ), osteopontin (OPN), osteocalcin (OCN)] of the three groups were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction after 7 days and 14 days of induction to evaluate the differentiation ability of hADSCs. The diameter of antibacterial zone was measured, and antibiotic positive controls (minocycline group and ciprofloxacin group) were set, and the antibacterial activity of the transfected hADSCs against the periodontal pathogens such as Staphylococcus and Porphyromonas was detected.
ResultsAt 7 and 14 days of induction, the relative expressions of ALP, Col-Ⅰ, OPN and OCN mRNA in the no-load group and the experimental group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05); the relative expressions of ALP, Col-Ⅰ, OPN and OCN mRNA in the no-load group and the experimental group at 14 days induction were significantly higher than those of 7 days after induction(P < 0.05). In the Staphylococcal antibacterial experiment, the inhibition zone of the low-density group was significantly smaller than that of the minocycline group and ciprofloxacin group, the zone of inhibition in the medium-density group was significantly greater than that in the ciprofloxacin group, the zone of inhibition in the high-density group was significantly greater than that of the minocycline group and ciprofloxacin group (P < 0.05). In the bacteriostasis experiment of Porphyromonas, the inhibition zone of the low-density group was significantly smaller than that of the minocycline group and the ciprofloxacin group, the inhibition zone of medium-density group group was significantly higher than that of minocycline group, and was significantly higher in the high-density group than that of the minocycline group and the ciprofloxacin group (P < 0.05).
ConclusionhβD-3 transfection can promote the osteogenic differentiation of hADSCs, and has good antibacterial activity against periodontal pathogens such as Staphylococcus and Porphyromonas.
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顽固性慢性便秘病程长，治疗困难，疗效差，严重影响患者生活、学习及工作质量。长期性排便困难会加重心理负担，严重者甚至引发长期焦虑和抑郁，心理疾病会影响胃肠道功能从而加重便秘症状，长久以往形成恶性循环[1-3]。顽固性慢性便秘分为慢传输型、出口梗阻型及混合型，经内科严格的保守治疗疗效欠佳的患者，最终大多选择手术治疗，手术方式主要包括全结肠切除联合回肠-直肠吻合术、次全结肠切除联合盲肠-直肠或回肠-乙状结肠吻合术、直肠悬吊固定术、经肛吻合器直肠切除术等[4]。2000年，南京军区南京总医院对此类患者开展了金陵术，该术式能同时解决慢传输和出口梗阻问题，能够取得令患者满意的长期疗效[5]。近年来，随着微创技术及理念的更新，经自然腔道取标本手术(NOSES)受到越来越多的关注, NOSES应用于金陵术避免了腹部横切口，具有手术创伤更小、腹壁美容效果更佳、术后切口愈合更快、切口并发症更少等优势，对于年轻女性、术后腹壁美容效果要求较高、瘢痕体质等患者而言, NOSES联合金陵术是更优选择。本研究回顾性收集苏北人民医院接受NOSES联合金陵术的顽固性便秘患者的临床资料，初步观察NOSES联合完全腹腔镜下金陵术治疗顽固性便秘的安全性、可行性及临床应用价值，为NOSES在便秘治疗中的应用提供一定临床依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
通过电子病历系统回顾性收集2016年3月—2021年8月苏北人民医院胃肠外科因顽固性便秘行金陵术治疗的患者的资料。根据纳入和排除标准筛选出金陵术联合NOSES的患者21例，其中女16例，男5例; 平均年龄(57.7±16.6)岁; 体质量指数(BMI)为18.2~23.2 kg/m2, 平均(21.1±1.5) kg/m2; 患者便秘病程为4~38年，平均(19.4±9.4)年; 合并高血压、糖尿病等其他基础疾病者8例。纳入标准: ①符合罗马Ⅳ便秘诊断标准者; ②经药物、中医科、针灸科、心理、生物反馈、菌群移植、骶神经刺激等单学科或多学科联合正规非手术治疗效果欠佳或无效果者; ③经电子结肠镜、钡灌肠等检查证实无结直肠器质性病变者; ④术前经改良结肠慢传输试验(图 1)、排粪造影(图 2)、直肠测压、盆底功能筛查等检查，符合慢传输型和出口梗阻型顽固性便秘的诊断者; ⑤病史较长，且严重影响生活质量，有强烈手术意愿者; ⑥自愿接受NOSES联合金陵术治疗者。排除标准: ①伴有严重精神障碍者; ②麻醉术前评估不能耐受腹腔镜手术或有凝血功能障碍等其他手术禁忌证者; ③既往有直肠外伤或直肠手术史者; ④有消化道器质性病变者; ⑤中转开腹或NOSES开展失败者; ⑥术后随访失联者。
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图 1 改良结肠慢传输试验A: 正常对照(钡剂完全排空); B: 慢传输型便秘(钡剂残留在结肠); C: OOC型便秘(钡剂残留在直肠); D: 混合型便秘(钡剂残留在结直肠内)。1.2 NOSES联合金陵术方法
全身麻醉气管插管后，患者摆仰卧“大”字体位，腹部取4个戳卡孔，脐下缘取1.0 cm切口并置入10 mm鞘卡为镜头孔，其余分别为脐水平部左右腋前线各取0.5 cm切口并置入5 mm鞘卡，脐上约5 cm处取1.2 cm切口为主操作孔，置入12 mm鞘卡。自尾侧入路游离回盲部和升结肠，完全游离右半结肠，向左游离横结肠，至脾区向下游离降结肠和乙状结肠至直乙交界处，继续向下游离直肠至尾骨尖水平，充分游离结肠后，患者更换为截石位，冲洗、扩肛后经肛门取标本并行肠吻合术，改良的NOSES联合金陵术见图 3。
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图 3 NOSES联合金陵术手术示意图A: 戳卡位置; B: 打开胃结肠韧带; C: 游离升结肠; D: 离断结肠中血管; E: 游离结肠脾区; F: 游离降结肠; G: 游离直肠后壁至尾骨尖水平; H: 打开直肠; I: 切除阑尾; J: 从肛门置入吻合器钉座; K: 在回盲部结肠置入吻合器钉座; L: 经直肠拖出标本; M: 闭合直肠残端并置入吻合器; N: 升结肠-直肠端侧吻合; O: 升结肠-直肠侧侧吻合。1.3 疗效评估
记录术中出血量、手术时间、术后住院时间及术后并发症情况。术后并发症包括吻合口并发症(出血、瘘、狭窄)、尿潴留、性功能障碍、肠梗阻等。术后随访指标包括胃肠生活质量指数(GIQLI)评分、Wexner便秘评分、每周完全自发排便(SCBM)次数、排便满意度、切口美容效果满意度、焦虑自评量表(SAS)评分和抑郁自评量表(SDS)评分。美容效果满意度: 满意为切口平坦，无明显瘙痒刺激感，且瘢痕肉眼几乎不可见; 基本满意为切口稍凸起或凹陷，舒适且无明显瘙痒刺激感，瘢痕肉眼可见; 不满意为切口欠平坦，瘙痒感明显，瘢痕明显，严重影响美观。
1.4 统计学方法
采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行分析。采用(x±s)表示符合正态分布的计量资料，组间比较采用独立样本t检验, P＜0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 手术结果
21例顽固性便秘患者均成功完成NOSES腹腔镜辅助金陵术，平均手术时间为(284.8±34.3) min, 术中出血量(45.7±9.3) mL, 平均住院时间为(9.2±1.1) d。6例(28.6%)患者发生并发症，其中吻合口出血2例(9.5%)、腹腔感染1例(4.7%)、吻合口瘘2例(9.5%)、术后肠梗阻1例(4.7%), 无术后切口感染或愈合不良，无死亡患者(见表 1)。1例吻合口出血患者通过肛门内去甲肾上腺素局部灌洗治疗后好转，另外1例通过止血药物对症治疗后好转。腹腔感染患者根据药物敏感试验结果针对性全身使用抗生素、引流管持续生理盐水冲洗保守治疗后引流液转清治愈。吻合口瘘患者行回肠末端造口术，术后予以保守治疗后好转, 3个月后经肛门钡灌肠发现吻合口通畅、无吻合口瘘等明显异常后行回肠造口还纳后恢复。肠梗阻患者予以禁食、胃肠减压、营养支持、调节肠道菌群，辅以胃肠促动力药及中医针灸治疗后好转。
表 1 便秘患者临床资料特征患者编号 性别 年龄/岁 合并症 体质量指数/(kg/m2) 便秘时间/年 手术时间/min 术中出血量/mL 并发症 1 女 22 无 18.3 10 195 20 吻合口出血 2 男 68 糖尿病 20.2 20 280 50 吻合口瘘 3 男 76 高血压 20.4 32 310 50 无 4 男 73 高血压 23.1 15 310 50 无 5 女 25 无 21.2 5 270 30 无 6 女 74 糖尿病 19.6 30 300 50 腹腔感染 7 女 56 无 22.2 10 275 50 无 8 女 53 无 20.4 12 280 50 无 9 女 54 无 21.5 20 280 50 无 10 女 47 无 23.2 22 265 50 无 11 女 73 高血压 21.6 30 320 50 无 12 女 66 无 20.8 10 300 50 无 13 男 72 糖尿病 22.5 30 315 50 吻合口瘘 14 女 68 无 21.8 38 320 50 无 15 男 71 糖尿病 23.2 25 330 50 吻合口出血 16 女 51 无 20.5 19 285 50 无 17 女 35 无 20.1 10 280 30 无 18 女 19 无 18.2 4 200 30 无 19 女 43 无 22.7 20 280 50 无 20 女 45 无 19.5 25 285 50 无 21 女 50 高血压 21.4 20 300 50 术后肠梗阻 2.2 随访结果
患者术后1个月时GIQLI评分为(43.9±5.9)分，低于术前的(53.0±5.1)分，但术后3个月开始GIQLI评分逐渐增高。患者术后1个月Wexner便秘评分为(13.1±2.5)分, 3个月为(11.1±2.4)分, 6个月为(8.1±2.0)分, 12个月(5.9±1.4)分，术后不同时点评分与术前的(23.8±3.5)分比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。患者术前SCBM次数为(0.4±0.3)次/周，术后1个月为(7.7±1.6)次/d, 术后3个月为(6.1±1.1)次/d, 术后6个月为(4.8±1.1)次/d, 术后12个月为(4.1±0.9)次/d。患者术后早期出现腹泻，每天多达10余次，患者排便次数随着术后时间的延长逐渐减少，随着患者排便次数趋于正常，患者焦虑及抑郁情绪逐渐改善，术后6~12个月基本恢复正常，见表 2。术后不同时点，患者总体排便满意率分别为57.1%、50.0%、80.0%、80.0%, 见表 3。术后1个月, 8例(38.1%)患者满意, 12例(57.1%)基本满意, 1例(4.8%)不满意; 术后3个月, 10例(50.0%)患者满意, 9例(45.0%)基本满意, 1例(5.0%)不满意; 术后6个月, 10例患者满意, 5例(33.3%)基本满意，无不满意患者; 术后12个月, 8例(80.0%)患者满意, 2例(20.0%)基本满意，无不满意患者，见表 4。
表 2 顽固性便秘患者手术前后GIQLI评分、Wexner便秘评分、SAS评分及SDS评分比较(x±s)分 项目 术前(n=21) 术后1个月(n=21) 术后3个月(n=20) 术后6个月(n=15) 术后12个月(n=10) 胃肠生活质量指数评分 53.0±5.1 43.9±5.9* 63.1±7.3* 87.6±9.7* 103.7±9.7* Wexner便秘评分 20.3±4.0 13.1±2.5* 11.1±2.4* 8.1±2.0* 5.9±1.4* 焦虑自评量表评分 59.3±8.2 56.2±7.5 54.3±7.7 50.8±7.2* 42.2±6.8* 抑郁自评量表评分 58.6±6.6 55.8±7.0 54.3±6.9 46.4±5.8* 40.7±5.9* 与术前比较, * P＜0.05。 表 3 术后排便满意度情况[n(%)]术后随访时间 n 非常满意 满意 一般 不满意 随访1个月 21 3(14.3) 9(42.8) 9(42.9) 0 随访3个月 20 5(25.0) 5(25.0) 8(40.0) 2(10.0) 随访6个月 15 7(46.7) 5(33.3) 2(13.3) 1(6.7) 随访12个月 10 5(50.0) 3(30.0) 2(20.0) 0 表 4 术后腹壁美容效果满意度情况[n(%)]术后随访时间 n 满意 基本满意 不满意 随访1个月 21 8(38.1) 12(57.1) 1(4.8) 随访3个月 20 10(50.0) 9(45.0) 1(5.0) 随访6个月 15 10(66.7) 5(33.3) 0 随访12个月 10 8(80.0) 2(20.0) 0 3. 讨论
膳食结构改变及精神心理压力、社会因素等多重因素导致便秘人群日益增多[6], 患者生活及工作质量受到严重影响，甚至会出现严重焦虑或抑郁情绪[7-8]。当规范的内科药物治疗及骶神经刺激、中医针灸、菌群移植和生物反馈等治疗无效时，手术成为最终选择。目前，各种治疗便秘的术式适应证及禁忌证不同[9-10], 存在远期效果欠佳、手术时机把控不准确、并发症发生率较高等问题[11-12]。金陵术既能解决慢传输的问题，也能解决出口梗阻的多种肛门解剖异常等问题[13]。文献[14-18]证实，NOSES联合金陵术的手术方式创伤更小，具有良好的美容效果和满意的长期疗效，能极大缓解患者焦虑、抑郁状态。
本研究共21例患者开展NOSES联合金陵术，围术期观察及短期随访结果显示效果较好。手术治疗的最终目的是缓解症状和提高生活质量，本研究患者术后1个月时GIQLI评分较术前降低，与术后患者短期出现腹泻有关，术后3、6个月时，其评分逐渐增高, 12个月时显著增高。Wexner便秘评分随着术后时间的延长而降低。手术治疗后，患者的排便次数逐渐增多，术后早期普遍出现腹泻，排便次数多者每天可达数十次，口服易蒙停、蒙脱石散或黄连素后排便次数逐渐减少，患者排便满意度明显增加。
传统的腹腔镜金陵术的腹部有横切口用于取标本[5], 但NOSES联合金陵术腹部无切口。手术疤痕大小及数量是影响术后满意度的主要因素，其次疤痕所致的疼痛、瘙痒也会降低患者满意度。此外，年轻女性对腹壁切口美容效果要求更高。本研究术后3个月进行了腹壁切口满意度的调查，结果证实, NOSES术式的腹壁无横切口，更微创，美容效果较好，极大提高了患者满意度。
研究[19]表明，顽固性便秘导致患者焦虑和抑郁日益加重，交感神经控制胃肠道括约肌的收缩，严重的心理障碍会兴奋交感神经，抑制胃肠道蠕动，使便秘症状进一步加重[20]。此外，脑长轴高级中枢受到外在刺激或在肠内信号传递的脑肠肽的影响下，胃肠感觉、运动及分泌等会改变[21]。胃肠道感觉和运动障碍会影响情感中枢，诱发多种情绪异常[22-24], 两者互为因果，导致恶性循环。患者术前存在不同程度焦虑、抑郁情绪，且未经正规治疗。手术后，患者排便次数增多，排便满意度逐渐上升，术后6、12个月SAS评分和SDS评分下降，心理障碍明显改善。患者心理障碍改善的可能机制: ①金陵术同时解决了慢传输和出口梗阻的病因，排便症状的改善缓解了患者的躯体症状，从而逐渐改善心理状态; ②胃肠道功能的恢复以及通过脑肠轴对情感中枢的作用缓解焦虑、抑郁状态; ③ NOSES联合金陵术腹壁无横切口，更加微创，良好的腹部美容效果有效缓解患者的焦虑和抑郁情绪; ④完善的术前准备和围术期正确的心理诱导增强了患者信心，患者对手术疗效更满意。
严格把控实施NOSES联合金陵术患者的适应证、手术指征和诊断标准，包括: ①符合罗马Ⅳ便秘诊断标准; ②改良结肠慢传输时间明显延长; ③排粪造影提示直肠前突; ④严格的系列保守治疗效果欠佳或无效果; ⑤排除结直肠器质性疾病; ⑥ BMI＜30 kg/m2, 既往无直肠外伤或手术史，肛门无疾患或狭窄; ⑦无严重精神障碍。NOSES联合金陵术注意事项: ①术前需调整患者营养状态，肠道准备完善; ②预防性使用抗生素; ③自然腔道反复碘伏水冲洗; ④一次性保护套保护自然腔道; ⑤术中离断直肠前将直肠拉直，在腹膜返折上部10 cm处使用球鞋带结扎肠管(避免肠液溢出污染腹腔); ⑥盆腔放置双套管以便术后观察有无吻合口瘘及术后冲洗。
综上所述, NOSES联合金陵术能缓解患者便秘症状，改善患者学习、工作及生活质量，改善患者焦虑、抑郁状态，且术后腹壁美容效果更佳。
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图 1 hADSCs的镜下观察及表面抗原表达
A: 原代hADSCs(放大100倍); B: 第3代hADSCs(放大100倍); C: CD29表达; D: CD44表达。
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图 4 ALP、Col-Ⅰ、OPN、OCN mRNA相对表达量
A: ALP mRNA相对表达量; B: Col-Ⅰ mRNA相对表达量; C: OPN mRNA相对表达量; D: OCN mRNA相对表达量。与对照组比较, *P < 0.05; 与诱导7 d时比较, #P < 0.05。
表 1 各组抑菌圈直径比较(x±s)
mm 组别 葡萄球菌抑菌圈直径 卟啉单胞菌抑菌圈直径 对照组 0.044±0.015 0.045±0.011 低密度组 3.921±0.108***### 4.035±0.404***### 中密度组 5.246±0.176### 5.373±0.519*** 高密度组 6.041±0.164***### 6.085±0.637***### 米诺环素组 5.325±0.112 4.597±0.415 环丙沙星组 4.468±0.134 5.492±0.507 空载组 0.031±0.011 0.032±0.009 与米诺环素组比较, * * * P < 0.05;
与环丙沙星组比较, ###P < 0.05。
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期刊类型引用(1)
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