Roles and molecular mechanism of microRNA-491 on proliferation, invasion and migration of cervical cancer cells
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摘要:目的 探讨微小RNA-491(miR-491)在宫颈癌(CC)细胞增殖、侵袭及迁移中的作用及分子机制。方法 收集CC患者的58对癌组织及癌旁组织标本；采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测CC组织和癌旁组织(对照组)中miR-491和爪蟾驱动蛋白样蛋白2的靶向蛋白(TPX2)的表达水平。将CC细胞系中的Hela和HT-3细胞随机分为NC组[磷酸盐缓冲液(PBS)处理]、miR-491组(过表达miR-491处理)、si-TPX2组(抑制TPX2)、TPX2组(过表达TPX2)及miR-491+TPX2组(同时过表达miR-491和TPX2)。采用细胞活力和克隆形成实验测定miR-491对CC细胞增殖能力的影响；采用双荧光素酶报告实验验证miR-491和 TPX2 的靶向关系；采用划痕和侵袭实验检测miR-491对CC细胞侵袭和迁移能力的影响；构建裸鼠成瘤模型验证miR-491和TPX2对肿瘤生长的影响。结果 miR-491在CC组织和细胞中的表达降低，而TPX2的表达升高，差异有统计学意义(P<0.05)。过表达miR-491能够抑制CC细胞的细胞增殖。双荧光素酶报告结果表明，与NC组比较, miR-491模拟物可以降低PmirGLO-TPX2-3′UTR WT的荧光素酶活性，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞活力和凋亡检测结果发现, miR-491能够通过调控TPX2抑制细胞增殖来增高细胞凋亡率。进一步的划痕和transwell检测结果发现, miR-491过表达能够抑制细胞的迁移和侵袭，而TPX2过表达能够促进细胞迁移和侵袭。肿瘤体积和质量检测结果发现, miR-491能够抑制肿瘤生长，而TPX2过表达能够促进肿瘤生长且这种促进作用能够被miR-491逆转。苏木精-伊红染色(HE)检测发现, miR-491组的肿瘤组织出现部分坏死，而TPX2组肿瘤细胞增殖明显。结论 miR-491能够通过调控TPX2的表达影响CC进程，为未来CC生物标志物的选择及治疗靶点提供理论依据。Abstract:Objective To investigate the roles and molecular mechanism of microRNA-491 (miR-491) in the proliferation, invasion and migration of cervical cancer (CC) cells and its molecular mechanism.Methods A total of 58 pairs of cancer tissue and paracancerous tissue samples from CC patients were collected. The expression levels of miR-491 and Xenopus kinesin-like protein 2 target protein (TPX2) in CC tissues and paracancerous tissues were detected by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). Hela and HT-3 cells of CC cell line were randomly divided into NC group[phosphate buffer (PBS) treatment], miR-491 group (overexpression of miR-491 treatment), si-TPX2 group (inhibition of TPX2), TPX2 group (overexpression of TPX2) and miR-491+TPX2 group (simultaneous overexpression of miR-491 and TPX2). Cell viability and clone formation assays were used to determine the effect of miR-491 on the proliferation ability of CC cells. The targeting relationship between miR-491 and TPX2 was verified by dual-luciferase reporter assay. Scratch and invasion assays were used to detect the effect of miR-491 on the invasion and migration of CC cells. A nude mouse tumorigenic model was constructed to verify the effects of miR-491 and TPX2 on tumor growth.Results The results of the study showed that the expressions of miR-491 in CC tissues and cells were significantly reduced, while the expressions of TPX2 were significantly increased, and the differences were statistically significant (P<0.05). Overexpression of miR-491 could inhibit the cell proliferation of CC cells. The results of the dual luciferase report showed that miR-491 could significantly reduce the luciferase activity of PmirGLO-TPX2-3′UTR WT compared with the NC group (P<0.05). The test results of cell viability and apoptosis found that miR-491 mimics can significantly inhibit cell proliferation and increase the rate of apoptosis by regulating TPX2. Further scratches and transwell detection revealed that the miR-491 overexpression inhibited cell migration and invasion, while overexpression of TPX2 could promote cell migration and invasion. In addition, this effect was reversed by the overexpression of miR-491. From the results of tumor volume and weight detection, it is found that miR-491 could inhibit tumor growth, while overexpression of TPX2 can promote tumor growth, and its promotion effect was reversed by miR-491. Further detection of hematoxylin and eosin staining(HE) showed that the tumor tissues in the miR-491 group showed partial ring necrosis, while the tumor cell proliferation effect in the TPX2 group was obvious.Conclusion This study confirms that miR-491 can affect the progress of CC by regulating the expression of TPX2, which provides a theoretical basis for the selection of cervical cancer biomarkers and therapeutic targets in the future.
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Keywords:
- cervical cancer /
- microRNA-491 /
- cell proliferation /
- cell migration /
- tissue necrosis /
- cell vitality
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青春发育是指人类的性器官由未成熟发育为具备生殖能力的状态，进而踏入成年期前的一个阶段。在发育期，下丘脑-垂体-性腺轴(HPGA)逐步发育成熟，引发身高增长加速、生殖器官开始成熟，并出现第二性征[1]。下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的脉冲增加使垂体产生促性腺激素，进而引起性腺成熟和性腺类固醇激素的产生[2]。性腺类固醇激素的增高引起第二性征的成熟。GnRH激发试验主要用于儿童青春期疾病的诊断检查，以评估HPGA的活动[1, 3]。然而, GnRH激发试验仍有一些不便之处，如血清促性腺激素呈脉冲式分泌，但单次基础血清促性腺激素(Gn)水平测定很难反映其分泌情况[4]; GnRH激发试验很耗时，需要重复采样，属于一种有创检查。作为评估HPGA功能的另一种非侵入性方法，尿促性腺激素(UGn)测量值得推荐[5-6]。现将UGn在评估儿童性发育中的研究进展综述如下。
1. 促黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH) 检测技术
1943年, CATCHPOLE H采用生物效价法每日对12名女童(4~14岁)的UGn进行测定，但因其操作复杂、费时费力，故未能得到有效推广。随着促性腺激素检测技术的发展, 1959年放射免疫分析法(RIA)问世，但其存在放射性污染的缺点，且这类免疫测定方法通常灵敏度不高，难以准确测定未浓缩尿中的低浓度LH、FSH的含量[7]。1988年，以单克隆抗体为基础的非竞争性生物素——亲和素免疫测定方法(NABA)出现，并用于检测晨尿LH含量。采用放射性同位素、荧光物质和化学发光物代替酶，即可建立各种不同的NABA法，如免疫放射测定法(IRMA)、免疫荧光测定法(IFMA)和免疫化学发光法(ICMA)等[7]。其中，IFMA或ICMA等可直接检测UGn，无需萃取，检测的可重复性较好[8]。目前, ICMA已被普遍应用于临床血清Gn检测。
2. 关于尿液标本的留取时间与肌酐(Cr) 校正
血清Gn浓度在青春前期和整个青春期在夜间以脉冲方式分泌增加，而晨尿有望反映这种夜间分泌的升高[6, 9]。目前临床多采用任意定时尿或晨尿Gn作为24 h血清Gn分泌情况的估测。目前国外文献报道多以晨尿研究为主。在国内关于UGn与儿童性发育的相关研究中，不乏有关定时尿Gn的文献报道。谢书艳等[10]收集40例因发育异常入院行促性腺激素释放激素类似物(GnRHa)激发试验的患儿昼夜12 h尿，结果发现昼夜12 h尿Gn有助于儿童HPGA的启动诊断，且其联合检测可能优于单独日间或夜间检测。
目前，有关儿童行GnRH或GnRHa激发试验时UGn动态变化的研究甚少，在临床研究中难以选择最佳留尿时间。国内研究[11]对23例入院行GnRHa激发试验的患儿进行研究，注射曲谱瑞林后，连续收集9个分段(首段1.5 h, 其余各段为1 h)尿，发现GnRHa激发试验中连续分段UGn可反映儿童血Gn动态变化。无创便捷的GnRHa激发试验(ICMA) 尿检测法临床相关研究的适宜时间段为激发试验的48 h内，最佳时间窗可能为激发试验的24 h内[12]。其中，在GnRHa激发试验中连续分段收集4.5 h尿液检测UGn, 其评估儿童HPGA启动的价值优于血自发性Gn和自发性夜间12 h UGn[13]。以上研究提示, GnRHa激发试验中连续分段UGn可反映儿童血Gn动态变化，为选取最佳留尿时间提供了线索。基于此，研究发现，激发后4 h总尿黄体生成素(ULH)及ULH/UFSH比值对鉴别乳房早发育(PT)和中枢性性早熟(CPP)均有一定意义[14], 但这均是基于曲谱瑞林激发试验展开的研究，而曲谱瑞林的激发作用比天然GnRH作用强数十倍，因此可能存在假阳性结果，目前一般不推荐常规诊断使用，且上述研究病例数量有限，尚缺乏这方面研究的有力论证。
此外，尿液样本的稀释度不同会引起相应的尿液溶质浓度改变，因此可能需要调整尿液浓度以避免因水合作用引起的误差[15]。渗透压、尿比重和Cr可用于调节水合作用[16]。研究[17]表明，与Cr相比，尿比重表现出更高的时间一致性，更适合校正儿童尿量的变异性，尽管肌酐校正在超重和肥胖儿童中也有很好的效果。
目前，国内外关于UGn与其相应血清促性腺激素的相关性研究多数采用Cr校正。然而也研究认为, Cr会导致过度校正，反而使UGn与血清Gn的相关性减弱，如SINGH G K S等[18]研究发现，与经Cr校正后的晨UGn相比，未经Cr校正的晨UGn与相应血清Gn的相关性更高，因此提出青少年晨尿中的性腺类固醇激素和LH浓度不受水合状态的显著影响，可能不需要校正Cr, 但这可能不适合用于随机尿样，因为水合状态可能会有更大的变化。关于尿液样本中Gn是否需要经Cr校正，目前尚无定论，需要更多研究来证明。
3. UGn水平与儿童HPGA功能评估
青春期的开始是由GnRH的脉冲式释放启动的[2]。在HPGA激活后，血清Gn的水平在向青春期过渡时增高，进而刺激性腺成熟和性腺类固醇的产生[1, 3]。迄今为止，临床仍采用传统的GnRH激发试验作为评估HPGA功能的经典方法。随着灵敏的新型检测方法不断出现, UGn与血清Gn水平存在相关性被发现。
3.1 UGn可反映血清促性腺激素水平
0~6岁儿童经Cr校正的UGn水平随年龄增大呈下降趋势[19]。青春期男性ULH水平增加了约50倍，尿卵泡刺激素(UFSH)水平约增加了5倍，而女性在青春期ULH水平增加了约90倍，女性UFSH水平与男性基本相同[20]。UGn与Tanner分期也有良好的相关性，Tanner Ⅰ期到Ⅱ期的过渡期间，女性和男性ULH浓度都有所增加[21-22]。LUCACCIONI L等[23]通过免疫法测定非定时尿液样本中UGn并校正Cr，发现血LH和ULH/UCr、血FSH和UFSH/UCr之间存在明显相关性，证实UGn能可靠反映血清促性腺激素水平，这表明通过现代敏感测定法测定的UFSH和ULH水平可用于评估儿童时期促性腺激素的分泌[20]。因此, UGn浓度的检测可能有助于评估整个青春期的发育，也有助于检测青春期前到青春期的转变[21]。
一项单中心研究中, DEMIR A等[5]采用时间分辨夹心荧光免疫分析法比较了274例就诊儿童的晨尿促性腺激素、基础和GnRH激发试验后的血清促性腺激素水平，发现ULH、UFSH、ULH/UFSH与基础、GnRH激发试验的相应血清参数具有良好的相关性，且ULH和ULH/UFSH在预测青春期GnRH激发试验结果时的表现与基础血清LH相当。在HPGA启动的女性中, ULH/Cr、UFSH/Cr在24 h内升高, 48 h后逐渐降至基线。在HPGA未启动的女性中，虽然有相同的动态趋势，但是ULH/Cr或UFSH/Cr的振幅较低, 24 h后降至基线[24]。
3.2 ULH在评估青春期启动方面优于UFSH
青春期的开始预示着夜间促性腺激素分泌的增加，其特征是LH的脉冲式分泌比FSH更强。基础血清LH水平比血清FSH水平更能反映青春期发育过程，因为在青春期前和成年期之间血清LH增加了50~100倍，而血清FSH相应增加了大约10倍[25-26]。青春发育期间，血浆中LH的生物活性可增强5倍[27]。随着年龄和青春期的进展, UGn也随之增长，并且可以在晨尿中检测到[28]。ULH在12岁以前缓慢升高，此后在正常男童和女童中迅速升高，而UFSH在8岁时略有增加，此后男女童均无变化[29-30]。青春期UGn中主要升高的是ULH，但是UFSH升高早于ULH。
3.3 ULH在评估HPGA启动中的优势
青春期内分泌启动的标志是夜间继下丘脑GnRH脉冲式分泌增加后垂体LH脉冲分泌幅度增加，首次GnRH脉冲释放增加发生在临床青春期开始的前几年，仅在部分夜晚或伴随着深度睡眠的开始释放，因此这短暂的夜间活动不能被清晨血清LH检测到，但是可以通过检测ULH被发现[6]。KOLBY N等[28]研究发现，UGn水平在青春期开始之前便增加，其中晨尿ULH有一个关键性的增加，与性别无关[6]。这早于青春期临床表现，且比血清LH浓度增加早1~2年。因此，通过ULH检测评估青春期前期进展是有可能的[6]。
4. UGn应用于临床实践的可能性
UGn升高和(或)降低与青春期异常提前或延迟的正确诊断有关，测定UFSH和ULH可提供一种简便、灵敏、准确的儿童促性腺激素功能检测方法。
4.1 UGn可作为临床实践中对CPP女性的一种有效初筛方法
随机血清Gn在临床中可用于CPP的初筛，已有多种研究[31]证明UGn与血清Gn之间存在相关性，推测UGn也可作为CPP筛查的理想样本。SHIM Y S等[4]发现，晨尿和随机尿LH水平、晨尿和随机尿ULH/FSH均具有良好的诊断性能，随机尿Gn的诊断性能不低于晨尿Gn。因此，单次随机测定UGn浓度对女性CPP的初步筛查可能是有效的。ULH与血清LH呈正相关, ULH浓度为0.725 IU/L是反映GnRH激发试验阳性的临界值[32]。但这项研究的受试者数量很少，对数据统计学意义存疑，因此需要进一步的大规模前瞻性研究来证实随机尿促性腺激素的有效性。
晨尿Gn对早期预测PT转化为CPP具有一定的临床意义[33]。CPP患者中，ULH浓度>2 SD能够预测75%的患者呈阳性[28]。ZHAN S M等[34]对355名CPP女性进行了横断面研究，发现晨尿ULH和ULH/UFSH随着Tanner分期的进展显著增高，其中当ULH取1.74 IU/L时，其预测GnRH激发试验阳性的敏感性为69.4%, 特异性为75.3%, 另外当联合阈值ULH ≥ 1.74 IU/L+ ULH与UFSH比值>0.4, 其特异性达到86.6%。因此, ULH可作为CPP诊断和筛查的可靠指标。国内关于定时尿的相关研究[8]发现，夜间12 h尿ULH、UFSH、ULH/UFSH判断HPGA轴启动的灵敏性和特异性分别为90%、88%以上。夜间12 h ULH≥0.113 IU/L对女性CPP也具有筛查价值[35]。近5年国外相关研究得出的ULH截值点的总结见表 1。
表 1 ULH作为评估HPGA启动的指标ULH 敏感性/% 特异性/% 例数 时间 检测方法 参考文献 晨尿ULH > 1.75 IU/L 91.5 82.7 138(男) 2016 IFMA DEMIR A等[5] 晨尿ULH > 1.2 IU/L 80.0 74.0 52(女) 非定时ULH/Cr > 0.05 IU/mmol 86.0 71.0 41(男) 2016 CMIA LUCACCIONI L等[23] 晨尿ULH > 0.58 IU/L 91.9 63.2 100(女) 2019 DELFIA SHIM Y S等[4] 随机ULH > 0.2I U/L 77.4 73.7 晨尿ULH > 1.01 mIU/mL 92.3 100.0 68(女) 2020 ECLIA YVCE Ö等[36] 晨尿ULH > 1.74 IU/L 69.4 75.3 355(女) 2021 ICMA ZHAN S M等[34] 晨尿ULH > 1.74 IU/L, ULH/UFSH > 0.4 65.5 86.6 IFMA: 免疫荧光测定法; ICMA: 免疫化学发光法; CMIA: 化学发光微粒免疫测定;
DELFIA: 解离增强镧系元素荧光免疫检测; ECLIA: 电化学发光法。4.2 ULH可帮助区分快进展性早熟和慢进展性早熟
CPP是由于HPGA功能提前启动而导致女童8岁前、男童9岁前出现内外生殖器快速发育及第二性征出现的一种常见儿科内分泌疾病[37]。CPP可分为快速进展型、缓慢进展型、生长迟缓型。许多性早熟女童病情发展迅速，会出现初潮和骨骺生长板融合，如果不及时治疗，最终导致终身高降低，但目前尚无明确的界定标准。晨尿ULH在区分快进展性早熟和慢进展性早熟中起到了一定作用。ZUNG A等[38]对47例性早熟女孩随访6个月后，评估发育程度、生长速度和骨龄成熟程度，并将其分为慢进展组和快进展组。结果显示, ULH可以区分快进展组与慢进展组，而血清Gn无法区分。当ULH临界值取1.16 IU/L时，敏感性和特异性较高。因此，晨尿ULH是可靠的测定法，可能有助于区分慢进展组和快进展组。国内也有研究[39]表明，快进展青春期女童晨尿ULH较缓慢进展青春期女童升高，且晨尿ULH与基础血清LH、GnRH激发LH峰值有显著相关性，提示UGn测定无创、简便，对快进展青春期有一定诊断意义。
4.3 ULH可作为监测GnRHa治疗CPP女孩的一种方法
CPP患者通常在开始治疗90 d后通过重复行GnRH激发试验来检测GnRHa治疗的有效性。晨尿ULH水平与激发后血峰值LH水平呈高度正相关，与基础LH水平呈显著正相关，经GnRHa治疗后，尿LH和FSH浓度明显下降[32], 与KOLBY N、ZHAN S M等[28, 34]发现的情况一致，提示晨尿ULH水平可作为监测GnRHa治疗的可靠、灵敏的检测方法[36]。研究[40]发现, ULH测定或许可以用于监测HPGA抑制的某些逃逸，这是GnRH激发试验无法识别的现象。但是，也有研究[41]发现，单次定时尿液采集缺乏评估HPGA抑制的敏感性和特异性，不过这些研究是在一小群CPP患者中进行的，并且未被抑制的患者数量不足以确定ULH是否可用于预测治疗反应[36], 因此不能对ULH的可靠性进行任何预测。
4.4 尿促性腺激素在Turner综合征高促性腺激素状态中的临床应用
Turner综合征是由全部或部分体细胞中一条X染色体完全或部分缺失所致，这类患者发生原发性卵巢功能不全的风险增大。BONCOMPAGNI A等[42]通过对37名Turner综合征未成年女性患者进行回顾性队列研究，留取非定时尿液样本，发现在高促性腺激素状态下, ULH与血清LH呈正相关, UFSH是抗缪勒管激素(AMH) < 4 pmol/L的合理标志物。因此, ULH和UFSH也可作为高促性腺激素状态下评估卵巢功能的非侵入性、有用和可靠的标志物。此外, UGn联合尿性激素对明确小青春期的结束时间及年龄界定也存在一定意义[43]。
综上所述, UGn是一种无创、能反映血清Gn水平的参考指标，可作为CPP女性的一种有效初筛方法，有助于区分快进展性早熟和慢进展性早熟，对监测采用GnRHa治疗的CPP女性的疗效也具有一定作用。此外，在Turner综合征中, ULH可以作为评估卵巢功能的标志物，但需更多的研究证明其有效性。因此, UGn在评估性发育中可能具有较高的诊断价值。但是目前研究对于尿液标本的留取时间以及是否需要Cr校正尚存在争议，需更多的实验进行验证。另外，目前实验室检测方法的初始开发和研究的主要对象为人血清，且尿液样本的检测结果往往存在滞后性[8], 寻找高灵敏度的检测方法以及建立完善的实验室方法十分必要。最后，上述所有检测都需要在广泛人群中开展相关研究及全面分析，才能尽量避免实验的局限性。
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图 1 CC组织和癌旁组织中miR-491和TPX2的表达情况
A: qRT-PCR检测CC组织中miR-491的表达情况; B: qRT-PCR检测CC细胞系中miR-491的表达情况; C: qRT-PCR检测TPX2 mRNA在CC组织中的表达情况; D: miR-491和TPX2 mRNA的表达的相关性分析。
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图 2 miR-491对细胞增殖能力的影响
A: qRT-PCR验证各组miR-491的表达情况; B: CCK-8检测验证miR-491对细胞增殖的影响; C: 克隆形成实验验证miR-491对细胞增殖的影响。与NC组比较, *P<0.05, **P<0.01。
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图 3 miR-491与TPX2的靶向关系验证
A: qRT-PCR验证TPX2的表达情况; B: TPX2在细胞中的蛋白表达情况; C: 双荧光素酶报告实验验证miR-491与TPX2的靶向关系。
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图 4 miR-491通过TPX2调控Hela细胞的增殖、迁移及侵袭
A、B: 验证各组TPX2的表达情况; C: CCK-8检测各组细胞活力; D: 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况; E: 划痕实验验证各组细胞迁移情况; F: transwell实验验证各组细胞侵袭能力。
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图 5 miR-491通过TPX2调控HT-3细胞的增殖、迁移及侵袭
A、B: 验证各组TPX2的表达情况; C: CCK-8检测各组细胞活力; D: 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况; E: 划痕实验验证各组细胞迁移情况; F: traswell实验验证各组细胞侵袭能力情况。
表 1 临床样本信息
特征 miR-491表达情况 P 低表达(n=41) 高表达(n=17) 性别 男 23 9 0.825 9 女 18 8 年龄/岁 < 60 22 9 0.960 2 ≥60 19 8 TNM分期 Ⅰ~Ⅱ期 21 11 0.347 2 Ⅲ~Ⅳ期 20 6 T分期 T1~T2期 9 10 0.006 5 T3~T4期 32 7 淋巴结转移 无 33 9 0.032 6 有 8 8 
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表 2 各基因引物序列情况
基因名称 引物 序列 miR-491 上游 5′- ACACTCCAGCTGGGAGTGGGGAACCCTT-3′ 下游 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′ TPX2 上游 5′- ACCTTGCCCTACTAAGATT-3′ 下游 5′- AATGTGGCACAGGTTGAGC-3′ U6 上游 CTCGCTTCGGCAGCACA 下游 AACGCTTCACGAATTTGCGT GADPH 上游 5′- GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3′ 下游 5′-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC -3′
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