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ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞增殖和转移的影响及其分子机制

宋国全, 姜鹏, 李子华, 王宇驰

宋国全, 姜鹏, 李子华, 王宇驰. ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞增殖和转移的影响及其分子机制[J]. 实用临床医药杂志, 2022, 26(8): 99-103. DOI: 10.7619/jcmp.20214534
引用本文: 宋国全, 姜鹏, 李子华, 王宇驰. ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞增殖和转移的影响及其分子机制[J]. 实用临床医药杂志, 2022, 26(8): 99-103. DOI: 10.7619/jcmp.20214534
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SONG Guoquan, JIANG Peng, LI Zihua, WANG Yuchi. Influence of ST8SIA6-AS1 on proliferation and metastasis of osteosarcoma cells and its molecular mechanism[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2022, 26(8): 99-103. DOI: 10.7619/jcmp.20214534
Citation: SONG Guoquan, JIANG Peng, LI Zihua, WANG Yuchi. Influence of ST8SIA6-AS1 on proliferation and metastasis of osteosarcoma cells and its molecular mechanism[J]. Journal of Clinical Medicine in Practice, 2022, 26(8): 99-103. DOI: 10.7619/jcmp.20214534
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ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞增殖和转移的影响及其分子机制

  • 辽宁省辽阳市中心医院 手足显微外科, 辽宁 辽阳, 111000

详细信息

  • 中图分类号: R738.1;Q786

Influence of ST8SIA6-AS1 on proliferation and metastasis of osteosarcoma cells and its molecular mechanism

  • Department of Hand and Foot Microsurgery, Liaoyang City Central Hospital in Liaoning Province, Liaoyang, Liaoning, 111000

摘要

    摘要
  • 摘要:
    目的 

    探讨ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞增殖和转移的影响及其分子机制。

    方法 

    选取37例骨肉瘤患者的瘤组织及瘤旁组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ST8SIA6-AS1、miR-223-3p的表达水平。将骨肉瘤细胞U2OS分为si-ST8SIA6-AS1组、si-NC组、miR-223-3p mimic组、miR-NC组、si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor组、si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC组。采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖抑制率; 采用克隆形成实验检测细胞克隆形成数; 采用划痕实验检测细胞划痕愈合率; 采用Transwell检测细胞迁移数; 采用双荧光素酶报告实验检测ST8SIA6-AS1与miR-223-3p的靶向关系。

    结果 

    与瘤旁组织相比，骨肉瘤组织中ST8SIA6-AS1表达水平升高, miR-223-3p表达水平降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。沉默ST8SIA6-AS1或过表达miR-223-3p后, U2OS细胞增殖抑制率升高, U2OS细胞克隆形成数和迁移数减少, U2OS细胞划痕愈合率降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。ST8SIA6-AS1可靶向调控miR-223-3p; 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS的抑制作用。

    结论 

    ST8SIA6-AS1在骨肉瘤中高表达，沉默ST8SIA6-AS1可通过调控miR-223-3p抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖和迁移。

    Abstract:
    Objective 

    To explore the influence of ST8SIA6-AS1 on proliferation and metastasis of osteosarcoma cells and its molecular mechanism.

    Methods 

    The tumor tissues and adjacent tissues of 37 patients with osteosarcoma were selected, and the expression levels of ST8SIA6-AS1 and miR-223-3p were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). The osteosarcoma cells U2OS were divided into si-ST8SIA6-AS1 group, si-NC group, miR-223-3p mimic group, miR-NC group, si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor group, and si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC group. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was used to detect in hibitory rate of cell proliferation; clone formation test was used to detect formation number of cell clone; scratch test was used to detect healing rate of cell scratch; the transwell test was used to detect cell migration number; dual luciferase report test was used to detect the targeting relationship between ST8SIA6-AS1 and miR-223-3p.

    Results 

    Compared with the adjacent tissues, the expression level of ST8SIA6-AS1 in osteosarcoma tissue was significantly increased, and the expression level of miR-223-3p was significantly decreased (P < 0.05). After silencing ST8SIA6-AS1 or overexpression of miR-223-3p, the inhibitory rate ofU2OS cell proliferation was significantly increased, formation number of U2OS cell clone and migration number were significantly reduced, and healing rate of U2OS cell scratch was significantly reduced (P < 0.05). ST8SIA6-AS1 was able to target and regulate miR-223-3p; inhibiting miR-223-3p was able to reverse the inhibitory effect of silencing ST8SIA6-AS1 on U2OS.

    Conclusion 

    ST8SIA6-AS1 is highly expressed in osteosarcoma, and silencing ST8SIA6-AS1 can inhibit the proliferation and migration of osteosarcoma U2OS cells by regulating miR-223-3p.

    • HTML全文

  • 骨肉瘤是一种恶性程度较高的骨肿瘤，靶向治疗在特定的导向机制作用下可提高肿瘤局部治疗效果，因而从基因角度寻找精准的靶向治疗药物，或可提高骨肉瘤患者的临床疗法[1-2]。研究[3-4]表明，微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)在调节各种生物学和病理过程中具有关键作用，两者可作为肿瘤标志物和治疗靶点，为癌症诊治提供新的途径。研究[5]报道，微小RNA-223-3p(miR-223-3p)在骨肉瘤患者中表达下调, miR-223-3p过表达通过抑制钙黏蛋白6(CDH6)的表达而显著抑制骨肉瘤细胞侵袭、迁移和增殖。研究[6]还显示, miR-223-3p靶向抑制上皮细胞转化序列2(ECT2)的表达而抑制乳腺癌MDA-MB-468细胞的侵袭和迁移，促进细胞凋亡。生物学软件预测显示, miR-223-3p与lncRNA ST8SIA6-AS1有结合位点。研究[7]发现, ST8SIA6-AS1在肝癌组织和细胞中高表达, ST8SIA6-AS1的上调与侵袭性肿瘤表型及患者的总体生存率较差有关。研究[8]发现，下调ST8SIA6-AS1可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制ST8SIA6-AS1可抑制肺腺癌细胞恶性表型。目前, ST8SIA6-AS1对骨肉瘤细胞生物行为的影响仍不清楚。本研究探讨ST8SIA6-AS1在骨肉瘤中的作用，分析其调控机制与miR-223-3p的关系，现报告如下。

    1.   材料与方法

    1.1   组织材料

    选取2017年1月—2020年12月接受治疗的37例骨肉瘤患者的瘤组织及瘤旁组织，患者术前未进行过放化疗，所有患者均知情同意。

    1.2   细胞与主要试剂

    骨肉瘤细胞U2OS(美国ATCC); RPMI-1640培养基(美国Sigma); Trizol试剂、荧光定量试剂盒(日本Takara); 四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)试剂盒(美国ScienCell); Transwell小室(美国Corning); 结晶紫染色液、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。

    1.3   细胞处理与分组

    将骨肉瘤细胞U2OS常规培养于RPMI-1640培养基中，取对数生长期细胞，将ST8SIA6-AS1干扰表达载体及阴性对照、miR-223-3p模拟物及阴性对照转染至U2OS细胞，设为si-ST8SIA6-AS1组、si-NC组、miR-223-3p mimic组、miR-NC组; 将ST8SIA6-AS1干扰表达载体分别与miR-223-3p抑制剂及阴性对照转染至U2OS细胞，设为si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor组、si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC组。

    1.4   实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ST8SIA6-AS1和miR-223-3p的表达水平

    提取骨肉瘤组织、瘤旁组织及各组U2OS细胞的总RNA，合成互补DNA(cDNA)进行PCR，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

    1.5   MTT检测细胞增殖抑制率

    各组细胞培养48 h, 参考闫咨儒等[9]、刘经州等[10]实验方法检测490 nm处光密度值(OD490 nm值)。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

    1.6   克隆形成实验检测细胞克隆形成数

    将各组U2OS细胞接种于6孔板中，培养2周，经甲醇固定后用结晶紫染色，光学显微镜下计数大于50个细胞的集落。

    1.7   划痕实验检测细胞划痕愈合率

    将各组U2OS细胞接种于培养板中，过夜细胞铺满后用枪头在细胞表面直线划痕，用PBS冲洗划下的细胞，换液后继续培养，在培养0、48 h时拍照观察，采用Image-Pro Plus6.0软件计算划痕愈合率。

    1.8   Transwell检测细胞迁移数

    参考于守杰等[11]实验方法将100 μL细胞悬液加入Transwell小室上室，培养24 h, 4%多聚甲醛固定30 min, 0.1%结晶紫染色30 min, 擦去上室表面细胞，显微镜下观察并计算迁移数。

    1.9   双荧光素酶报告实验

    将ST8SIA6-AS1的野生型(wt-ST8SIA6-AS1)和突变型(mut-ST8SIA6-AS1)荧光素酶载体分别与miR-NC和miR-223-3p共转染至U2OS细胞，按说明书操作检测荧光素酶活性。

    1.10   统计学分析

    采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，本研究相关数据均为计量资料，且符合正态分布，采用(x±s)表示，组间比较行t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

    2.   结果

    2.1   ST8SIA6-AS1和miR-223-3p在骨肉瘤中的表达

    骨肉瘤组织中ST8SIA6-AS1表达水平高于瘤旁组织, miR-223-3p表达水平低于瘤旁组织，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1。

    表  1  骨肉瘤组织及瘤旁组织中ST8SIA6-AS1和miR-223-3p的表达(x±s)
    组织类型 n ST8SIA6-AS1 miR-223-3p
    瘤旁组织 37 1.03±0.16 1.02±0.15
    骨肉瘤组织 37 3.14±0.38* 0.43±0.07*
    与瘤旁组织比较, *P < 0.05。
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    2.2   沉默ST8SIA6-AS1对U2OS增殖、迁移的影响

    与si-NC组相比, si-ST8SIA6-AS1组ST8SIA6-AS1表达水平降低, miR-223-3p表达水平升高, U2OS细胞增殖抑制率升高, U2OS细胞克隆形成数和迁移数减少, U2OS细胞划痕愈合率降低，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 1、表 2。

    图  1  沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的影响
    A: 沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS划痕愈合(放大倍数100倍); B: 沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS迁移细胞数(放大倍数200倍)
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    表  2  沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS增殖及迁移(x±s)(n=9)
    组别 ST8SIA6-AS1 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    si-NC组 1.00±0 1.00±0 0 122.56±4.30 65.99±1.81 164.67±5.48
    si-ST8SIA6-AS1组 0.24±0.02* 3.80±0.08* 64.18±2.51* 58.56±3.37* 32.07±1.40* 68.00±2.94*
    与si-NC组比较, *P < 0.05。
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    2.3   ST8SIA6-AS1与miR-223-3p靶向关系的验证

    DIANA Tools预测发现ST8SIA6-AS1与miR-223-3p有互补序列，见图 2; miR-223-3p与wt-ST8SIA6-AS1共转染后细胞荧光素酶活性降低，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。

    图  2  ST8SIA6-AS1与miR-223-3p的互补序列(红色标注的是突变碱基)
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    表  3  双荧光素酶报告实验(x±s)(n=9)
    组别 wt-ST8SIA6-AS1 mut-ST8SIA6-AS1
    miR-NC组 0.96±0.11 1.02±0.12
    miR-223-3p组 0.39±0.40* 0.98±0.10
    与miR-NC组比较, *P < 0.05。
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    2.4   miR-223-3p对U2OS增殖及迁移的影响

    与miR-NC组相比, miR-223-3p mimic组中miR-223-3p表达水平升高, U2OS细胞增殖抑制率升高, U2OS细胞克隆形成数和迁移数减少, U2OS细胞划痕愈合率降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 3、表 4。

    图  3  沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的影响
    A: miR-223-3p抑制U2OS划痕愈合(放大倍数100倍); B: miR-223-3p抑制U2OS迁移细胞数(放大倍数200倍)。
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    表  4  miR-223-3p抑制U2OS增殖及迁移(x±s)(n=9)
    组别 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    miR-NC组 1.00±0 0 122.00±6.00 65.62±1.98 169.44±4.47
    miR-223-3p mimic组 2.80±0.08* 54.84±1.87* 71.67±4.50* 39.54±1.83* 81.44±3.47*
    与miR-NC组相比, *P < 0.05。
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    2.5   抑制miR-223-3p对沉默ST8SIA6-AS1处理的U2OS增殖及迁移的影响

    与si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC组相比, si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor组miR-223-3p表达水平降低, U2OS细胞增殖抑制率降低, U2OS细胞克隆形成数和迁移数增多, U2OS细胞划痕愈合率升高，差异均有统计学意义(P < 0.05)。见图 4、表 5。

    图  4  抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的抑制作用
    A: 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS划痕愈合的抑制作用(放大倍数100倍); B: 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移细胞数的抑制作用(放大倍数200倍)。
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    表  5  抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS增殖及迁移的抑制作用(x±s)(n=9)
    组别 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC 1.00±0 63.86±2.32 59.89±4.51 32.31±2.21 70.78±4.29
    si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor 0.34±0.03* 30.69±1.86* 103.89±9.17* 57.45±3.06* 143.00±4.97*
    与si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC组比较, *P < 0.05。
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    3.   讨论

    骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性骨癌，易转移和复发，为了达到更有效的治疗，需要为临床环境中的骨肉瘤治疗确定更具针对性的靶向疗法[12-14]。研究报道骨肉瘤患者组织、外周血及骨肉瘤细胞系中miR-223呈低表达, miR-223可作为骨肉瘤患者早期的有效诊断标志物; miR-223高表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能[15]。此外, miR-223-3p通过靶向矮小同源盒基因2(SHOX2)抑制口腔鳞状细胞癌的增殖和转移[16]。SNHG29通过Wnt/β-catenin信号通路调节miR-223-3p/CTNND1轴以促进胶质母细胞瘤进展[17]。本研究结果显示，骨肉瘤组织中miR-223-3p表达水平降低; 过表达miR-223-3p后U2OS细胞的增殖抑制率升高, U2OS细胞克隆形成数和迁移数减少, U2OS细胞的划痕愈合率降低，表明过表达miR-223-3p可抑制U2OS细胞增殖和迁移，提示miR-223-3p在骨肉瘤中起抑癌作用，与既往研究[5]结果一致。

    研究[18]报道ST8SIA6-AS1可通过抑制miR-145-5p/MAL2轴促进胆管癌进展; ST8SIA6-AS1通过调节miR-5195/PCBP2轴可促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭[19]; ST8SIA6-AS1通过p38 MAPK信号通路促进乳腺癌的增殖、迁移和侵袭[20]。上述研究表明ST8SIA6-AS1在多种肿瘤中起促癌作用。本研究结果显示，骨肉瘤组织中ST8SIA6-AS1表达水平升高，沉默ST8SIA6-AS1后U2OS细胞增殖抑制率升高，克隆形成数和迁移细胞数减少，细胞划痕愈合率降低，表明沉默ST8SIA6-AS1可抑制U2OS细胞增殖和迁移。ST8SIA6-AS1在骨肉瘤中的作用与其他肿瘤相似。本研究还发现ST8SIA6-AS1靶向调控miR-223-3p, 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS增殖及迁移的抑制作用。

    综上所述，ST8SIA6-AS1在骨肉瘤中高表达，沉默ST8SIA6-AS1可通过调控miR-223-3p抑制骨肉瘤U2OS细胞增殖和迁移。

  • 图  1   沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的影响

    A: 沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS划痕愈合(放大倍数100倍); B: 沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS迁移细胞数(放大倍数200倍)

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    图  2   ST8SIA6-AS1与miR-223-3p的互补序列(红色标注的是突变碱基)

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    图  3   沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的影响

    A: miR-223-3p抑制U2OS划痕愈合(放大倍数100倍); B: miR-223-3p抑制U2OS迁移细胞数(放大倍数200倍)。

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    图  4   抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移及划痕愈合的抑制作用

    A: 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS划痕愈合的抑制作用(放大倍数100倍); B: 抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS迁移细胞数的抑制作用(放大倍数200倍)。

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    表  1   骨肉瘤组织及瘤旁组织中ST8SIA6-AS1和miR-223-3p的表达(x±s)

    组织类型 n ST8SIA6-AS1 miR-223-3p
    瘤旁组织 37 1.03±0.16 1.02±0.15
    骨肉瘤组织 37 3.14±0.38* 0.43±0.07*
    与瘤旁组织比较, *P < 0.05。
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    表  2   沉默ST8SIA6-AS1抑制U2OS增殖及迁移(x±s)(n=9)

    组别 ST8SIA6-AS1 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    si-NC组 1.00±0 1.00±0 0 122.56±4.30 65.99±1.81 164.67±5.48
    si-ST8SIA6-AS1组 0.24±0.02* 3.80±0.08* 64.18±2.51* 58.56±3.37* 32.07±1.40* 68.00±2.94*
    与si-NC组比较, *P < 0.05。
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    表  3   双荧光素酶报告实验(x±s)(n=9)

    组别 wt-ST8SIA6-AS1 mut-ST8SIA6-AS1
    miR-NC组 0.96±0.11 1.02±0.12
    miR-223-3p组 0.39±0.40* 0.98±0.10
    与miR-NC组比较, *P < 0.05。
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    表  4   miR-223-3p抑制U2OS增殖及迁移(x±s)(n=9)

    组别 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    miR-NC组 1.00±0 0 122.00±6.00 65.62±1.98 169.44±4.47
    miR-223-3p mimic组 2.80±0.08* 54.84±1.87* 71.67±4.50* 39.54±1.83* 81.44±3.47*
    与miR-NC组相比, *P < 0.05。
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    表  5   抑制miR-223-3p可逆转沉默ST8SIA6-AS1对U2OS增殖及迁移的抑制作用(x±s)(n=9)

    组别 miR-223-3p 抑制率/% 克隆形成数/个 划痕愈合率/% 迁移细胞数/个
    si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC 1.00±0 63.86±2.32 59.89±4.51 32.31±2.21 70.78±4.29
    si-ST8SIA6-AS1+miR-223-3p inhibitor 0.34±0.03* 30.69±1.86* 103.89±9.17* 57.45±3.06* 143.00±4.97*
    与si-ST8SIA6-AS1+anti-miR-NC组比较, *P < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-11-17
  • 网络出版日期:  2022-04-27

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摘要
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  • 1.   材料与方法

  • 1.1   组织材料

  • 1.2   细胞与主要试剂

  • 1.3   细胞处理与分组

  • 1.4   实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测ST8SIA6-AS1和miR-223-3p的表达水平

  • 1.5   MTT检测细胞增殖抑制率

  • 1.6   克隆形成实验检测细胞克隆形成数

  • 1.7   划痕实验检测细胞划痕愈合率

  • 1.8   Transwell检测细胞迁移数

  • 1.9   双荧光素酶报告实验

  • 1.10   统计学分析

  • 2.   结果

  • 2.1   ST8SIA6-AS1和miR-223-3p在骨肉瘤中的表达

  • 2.2   沉默ST8SIA6-AS1对U2OS增殖、迁移的影响

  • 2.3   ST8SIA6-AS1与miR-223-3p靶向关系的验证

  • 2.4   miR-223-3p对U2OS增殖及迁移的影响

  • 2.5   抑制miR-223-3p对沉默ST8SIA6-AS1处理的U2OS增殖及迁移的影响

  • 3.   讨论

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