A study on mind mapping for diagnosis of a case of Fanconi syndrome with plantar pain as initial symptom
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摘要: 临床可见口服阿德福韦酯引起范可尼综合征的报道。本研究1例患者以足底痛为首发症状, 从发病至确诊时间长达2年，采用思维导图方法行发散性思考，最终确诊该病例为药源性范可尼综合征。本文分析患者长期未被确诊的因素，为临床医生降低误诊率提供指导。Abstract: Fanconi syndrome caused by oral taken of adefovir dipivoxil has been reported in clinic. This paper reported a case with plantar pain as the initial symptom, and was finally diagnosed as drug induced Fanconi syndrome through 2 years from onset to diagnosis by divergent thinking based on mind mapping method. This paper analyzed the factors that patient had not been diagnosed for a long time, so as to provide guidance for clinicians to reduce the misdiagnosis rate.
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Keywords:
- Fanconi syndrome /
- adefovir dipivoxil /
- nephrotoxicity /
- plantar pain /
- hepatitis B virus
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脓毒症是由严重感染引起的全身炎症反应综合征，其特征是感染灶产生的毒力因子进入血液循环，引发的全身炎症反应[1]。这些炎症反应进一步导致器官功能障碍，其中急性肺损伤(ALI)是最严重的并发症之一，其特点是肺组织受损导致肺功能急剧下降，诊治不及时可能进一步发展为急性呼吸窘迫综合征[2]。研究[2]表明, ALI的发病与炎性因子释放和损伤程度密切相关。炎性因子，特别是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1(IL-1)等，在脓毒症患者中起到重要的调节作用，可以刺激炎症细胞增殖和迁移，导致肺泡壁的炎症浸润和肺水肿形成[3]。目前，ALI的早期诊断和预后评估仍然是一个临床难题。因此，寻找新的生物标志物和分子指标对早期诊断、预测疾病进展和评估预后具有重要意义。
微小RNA(miRNA)可通过抑制靶基因的转录、调控蛋白翻译等方式发挥调控作用。研究[4]发现, miRNA在炎症反应中起到重要作用。miR-499a-5p是miR-499家族中的一员，已被发现参与多种生物过程，包括心脏疾病和肿瘤的进展[5]。但关于miR-499a-5p在脓毒症所致ALI中的作用及其与病情、预后的相关研究较少。生物信息学预测发现，成纤维细胞生长因子9(FGF9)存在与miR-499a-5p相互作用的结合位点。FGF9是一种与炎症相关的生长因子，已被证实在多种炎性疾病中起到重要调节作用[6]。本研究探讨血清miR-499a-5p和FGF9的表达与ALI患者(脓毒症所致)炎性因子、病情和预后的关系，旨在为该病的检测、治疗提供新思路和理论依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2020年1月—2023年1月住院接受诊治的151例脓毒症患者为研究对象，年龄49~77岁。收集患者年龄、性别、体质量指数(BMI)、体温、氧合指数、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分以及IL-1、IL-6、TNF-α、C反应蛋白(CRP)水平。根据ALI的发生情况分为脓毒症并发ALI组(68例)和一般脓毒症组(83例)。根据氧合指数，将脓毒症并发ALI患者分为轻症组(23例)、中症组(26例)和重症组(19例)。以脓毒症并发ALI患者诊治28 d内的生存情况，分为预后良好组(43例)和预后不良组(25例)。另外，选择同期体检健康者151例为健康组。
纳入标准: ①患者均符合《中国脓毒症/脓毒性休克急诊治疗指南(2018)》[7]中关于脓毒症的诊治标准者; ② ALI患者根据2017年Kigali[8]修订的柏林定义判定; ③患者年龄>18岁且资料齐全。排除标准: ①由肺部手术、腐蚀性气体和溺水等情况造成的ALI者; ②病毒性疾病者; ③经临床确诊的肺癌、慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、肺纤维化等肺部疾病者; ④自身免疫疾病、血液系统疾病者。患者均知情并签署同意书。研究获得本院伦理委员会批准(审批编号LL20200016)。
1.2 方法
1.2.1 样品采集
采集脓毒症患者入院时及健康者体检时空腹静脉血样5 mL, 于无菌试管静置30 min后, 1 000 r/min离心20 min, 存于-80 ℃冰箱待测。
1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-499a-5p水平
待测样以Trizol试剂(上海源叶生物科技有限公司)提取总RNA，逆转录合成cDNA(逆转录试剂盒由北京天根生物有限公司提供)，内参为 U6 , 引物由Primer-BLAST网站设计，由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物序列见表 1。以cDNA为模板，通过LightCycler 480Ⅱ型qRT-PCR仪(美国ABI公司)检测血清miR-499a-5p水平，各样品重复3次，以2-△△Ct法计算目的基因miR-499a-5p的相对表达量。
表 1 qRT-PCR引物序列基因 上游引物5′-3′ 下游引物5′-3′ miR-499a-5p AGTTGGCTCACGGTTCTTTCAA ATCGCCATGGCCCGCATGTCGG U6 GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测FGF9及炎症因子水平
人FGF9、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP的ELISA试剂盒均购自合肥莱尔生物科技有限公司，酶标仪(型号: Varioskan LUX)购买于赛默飞世尔科技(中国)。严格按照说明书操作配置标准液，在酶标仪450 nm处测定各样品的吸光度值，并绘制回归线带入吸光度值计算血清FGF9及各炎症因子水平。
1.3 统计学分析
采用SPSS 25.0软件进行数据处理，计量资料均符合正态分布，以(x±s)表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验。采用Pearson法分别分析血清miR-499a-5p、FGF9与炎性因子的相关性, miR-499a-5p与FGF9间的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-499a-5p、FGF9对脓毒症并发ALI患者预后的预测效能。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 脓毒症并发ALI组、一般脓毒症组与健康组临床资料比较
脓毒症并发ALI组、一般脓毒症组与健康组年龄、性别、BMI和体温比较，差异无统计学意义(P>0.05), APACHEⅡ评分、miR-499a-5p、FGF9、IL-1、IL-6、TNF-α、CRP比较，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 3组间临床资料比较(x±s)指标 脓毒症并发ALI组(n=68) 一般脓毒症组(n=83) 健康组(n=151) 年龄/岁 50.34±7.18 50.17±8.12 49.22±5.25 性别 男 37 44 73 女 31 39 78 BMI/(kg/m2) 22.37±2.36 22.48±2.04 22.42±1.75 体温/℃ 37.97±2.28 37.52±4.16 36.84±4.35 APACHEⅡ评分/分 16.78±2.36# 13.65±1.87 — 氧合指数/mmHg 212.77±21.68# 334.28±29.82 — miR-499a-5p 0.87±0.07*# 1.15±0.14* 1.29±0.13 FGF9/(pg/mL) 137.38±14.22*# 147.58±18.19* 160.84±19.91 IL-1/(pg/mL) 23.77±3.19*# 17.84±2.57* 10.95±1.52 IL-6/(pg/mL) 16.14±2.13*# 10.87±1.65* 7.87±0.91 TNF-α/(ng/L) 17.31±2.09*# 13.18±1.44* 8.79±1.02 CRP/(mg/L) 26.49±3.78*# 20.74±3.52* 10.88±2.06 BMI: 体质量指数; APACHEⅡ: 急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ; FGF9: 成纤维细胞生长因子9; IL-1: 白细胞介素-1; IL-6: 白细胞介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; CRP: C反应蛋白。
1 mmHg=0.133 322 kPa。
与健康组比较, * P < 0.05; 与一般脓毒症组比较, #P < 0.05。2.2 血清miR-499a-5p、FGF9及炎性因子在不同病情程度患者中的表达水平
轻症组、中症组、重症组患者miR-499a-5p和FGF9水平依次降低，而炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平依次升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 3。
表 3 不同病情程度患者的miR-499a-5p、FGF9及炎性因子水平比较(x±s)指标 轻症组(n=23) 中症组(n=26) 重症组(n=19) miR-499a-5p 1.06±0.12 0.83±0.06* 0.71±0.06*# FGF9/(pg/mL) 169.67±15.58 134.09±13.37* 102.81±10.19*# IL-1/(pg/mL) 18.84±2.12 24.53±2.54* 28.69±3.07*# IL-6/(pg/mL) 12.12±1.83 16.77±2.05* 20.15±2.47*# TNF-α/(ng/L) 13.47±1.16 17.14±1.37* 22.19±2.39*# CRP/(mg/L) 16.18±2.04 27.62±2.83* 37.41±3.42*# FGF9: 成纤维细胞生长因子9; IL-1: 白细胞介素-1; IL-6: 白细胞介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; CRP: C反应蛋白。
与轻症组比较, * P < 0.05; 与中症组比较, #P < 0.05。2.3 血清miR-499a-5p、FGF9及炎性因子在不同预后患者中的表达水平
与预后良好组相比，预后不良组的miR-499a-5p、FGF9降低，炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α、CRP水平升高，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 4。
表 4 不同预后患者的miR-499a-5p、FGF9及炎性因子水平比较(x±s)指标 预后良好组(n=43) 预后不良组(n=25) miR-499a-5p 1.01±0.17 0.62±0.08* FGF9/(pg/mL) 151.67±19.17 112.81±14.34* IL-1/(pg/mL) 20.58±2.35 29.29±3.62* IL-6/(pg/mL) 12.65±1.91 22.15±2.54* TNF-α/(ng/L) 12.06±1.34 26.35±2.91* CRP/(mg/L) 19.45±1.71 38.59±4.48* FGF9: 成纤维细胞生长因子9; IL-1: 白细胞介素-1; IL-6: 白细胞介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; CRP: C反应蛋白。
与预后良好组比较, * P < 0.05。2.4 脓毒症并发ALI组的miR-499a-5p、FGF9与炎症因子的相关性
采用Pearson法分析ALI组miR-499a-5p、FGF9与炎症因子的相关性，结果显示，miR-499a-5p、FGF9与炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α和CRP水平呈负相关(P < 0.05), 见表 5。
表 5 脓毒症并发ALI组miR-499a-5p、FGF9与炎症因子的相关性指标 miR-499a-5p FGF9/(pg/mL) r P r P IL-1/(pg/mL) -0.463 0.013 -0.537 0.006 IL-6/(pg/mL) -0.619 <0.001 -0.552 <0.001 TNF-α/(ng/L) -0.438 0.021 -0.484 0.017 CRP/(mg/L) -0.514 0.005 -0.510 0.008 FGF9: 成纤维细胞生长因子9; IL-1: 白细胞介素-1; IL-6: 白细胞介素-6; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; CRP: C反应蛋白。 2.5 miR-499a-5p靶向FGF9的生物信息学分析
根据TargetScanHuman网站预测结果, miR-499a-5p与FGF9可能存在靶向关系，见图 1。
2.6 脓毒症并发ALI组miR-499a-5p、FGF9的相关性
经Pearson相关分析，脓毒症并发ALI组血清miR-499a-5p与FGF9表达呈正相关(r=0.447, P < 0.05), 见图 2。
2.7 血清miR-499a-5p、FGF9水平对脓毒症并发ALI患者预后的预测价值
miR-499a-5p、FGF9联合预测脓毒症并发ALI患者预后的曲线下面积(AUC)大于单独预测(Z二者联合-miR-499a-5p=2.864、Z二者联合-FGF9=2.126, P=0.004、0.034), 见表 6、图 3。
表 6 血清miR-499a-5p、FGF9对脓毒症并发ALI患者预后的预测价值变量 AUC 截断值 95%CI 灵敏度 特异度 Youden指数 miR-499a-5p 0.787 0.87 0.671~0.877 0.760 0.721 0.481 FGF9 0.809 130.11 pg/mL 0.696~0.894 0.720 0.860 0.581 二者联合 0.949 — 0.867~0.988 0.960 0.814 0.774 FGF9: 成纤维细胞生长因子9; AUC: 曲线下面积。 3. 讨论
脓毒症导致的ALI是脓毒症并发症中最常见的一种，其是导致患者病死率偏高的重要原因[9-12]。研究[13-15]显示，炎性因子在脓毒症相关ALI中发挥重要作用，当机体炎症调控因子失衡，患者往往会病情恶化，器官功能持续性下降，最终危及生命。近年来，脓毒症和ALI的治疗方法不断改进，但其预后仍然堪忧。因此，寻找敏感度且特异性高的生物标志物对早期诊治ALI至关重要。
miRNA在多种生理和病理过程中发挥调控作用，参与细胞增殖、分化、凋亡[16]。miRNA已被证实在多种疾病中具有调控作用，如心肌梗死和肾脏损伤[17]。miR-499a-5p已被证实在脓毒症及炎症反应中起到调控作用[18]。大鼠实验[19]证明，miR-499a-5p可靶向负调控质金属蛋白酶-16, 减轻炎症，进而减轻肺损伤。在CHEN Y L等[20]研究中，肺炎患者外周血中miR-499a-5p表达下调，炎性细胞因子表达异常增高，提示两者可能具有相关性。目前, miR-499a-5p是否与脓毒症所致ALI有关尚不明确。本研究比较脓毒症并发ALI组患者与一般脓毒症组患者的血清miR-499a-5p水平发现, miR-499a-5p水平下调，提示其可能参与了脓毒症导致的ALI发病过程。同时，本研究观察到炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α和CRP)水平在轻症组、中症组和重症组中呈递增趋势，而miR-499a-5p表达水平随疾病的严重程度增高而呈逐渐递减趋势，这表明miR-499a-5p可能在ALI的发展与抗炎机制有关。进一步相关性分析证实, miR-499a-5p与炎症因子表达均呈负相关，表明其可能通过抑制炎症信号通路来减轻病程。此外，预后不良组中的miR-499a-5p的表达水平显著降低，而炎症因子水平显著升高，这提示miR-499a-5p下调可能与疾病恶化、预后不良有关。ROC分析结果显示, miR-499a-5p预测脓毒症导致的ALI预后的效能较高，提示血清miR-499a-5p可作为预测脓毒症并发ALI患者预后的辅助检测指标。
本研究通过生物信息学预测到FGF9与miR-499a-5p存在相互作用的结合位点。既往研究[21]表明, FGF9是一种具有广泛生物学功能的多肽生长因子，可参与多种生物过程，主要作为细胞发育和组织修复的信号分子，其表达或突变与多种疾病相关。研究[22]发现, FGF9通过促进黏着斑激酶(FAK)、蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导可显著诱导肺癌细胞中的细胞增殖。研究[23]发现, FGF9表达下调促进了细胞脂质积累, FGF9通过自分泌方式调节肝脂代谢来缓解脂肪肝表型。此外, FGF9还和机体的炎症相关。研究[6]结果显示, FGF9可通过调节磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT信号通路的激活来减轻机体炎症。研究[24]表明, FGF9可调节长非编码RNA NEAT1缓解溃疡性结肠炎的炎症。但FGF9在脓毒症相关ALI中的研究较少。本研究中，与一般脓毒症组相比，脓毒症并发ALI组的FGF9水平下调，提示FGF9与脓毒症导致ALI的发生可能存在相关性。同时，发现FGF9的表达水平随着病情严重程度递减，与炎症因子表达趋势相反，这表明FGF9可能与ALI病情严重程度及炎症反应机制有关。进一步通过相关性分析证实, FGF9与炎症因子之间均呈负相关。此外, FGF9在预后不良组中显著下降，提示FGF9的下调可能与患者的预后情况相关。ROC曲线预测脓毒症并发ALI患者的预后情况表明, FGF9具有成为预测脓毒症并发ALI患者预后的辅助指标的潜力。
本研究还对脓毒症并发ALI患者的血清miR-499a-5p与FGF9的相关性进行了分析，发现两者间具有正相关性，这也提示两者间可能存在靶向关系，在脓毒症与ALI的发病机制中起到协同作用。本研究结果显示，与miR-499a-5p、FGF9单独预测相比，两者联合预测具有更高的AUC和灵敏度。这表明两者联合应用可以提高预测模型的诊断效能，可为临床评估脓毒症并发ALI患者的病程和预后提供新的生物学标志物，以及为疾病的早期诊断和治疗提供依据。但本研究存在一些限制：首先，样本容量相对较小，可能影响结果的稳定性；其次，本研究仅分析了患者入院时miR-499a-5p、FGF9的表达水平，未能进一步探究二者动态水平变化，后续将扩大样本量，深入分析二者作用机制。
综上所述, miR-499a-5p、FGF9水平与脓毒症所致ALI患者的炎性因子水平和预后相关。miR-499a-5p和FGF9或可作为潜在生物标志物用于脓毒症并发ALI的预后评估。
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