Expression of miR-1180 in non-small cell lung cancer and its clinical significance
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摘要:目的 探讨微小RNA-1180(miR-1180)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清及组织中的表达情况，并分析其与临床病理特征的关系及对疾病诊断、预后评估的价值。方法 选取NSCLC患者72例，另选取同期接受治疗的良性肺部疾病患者50例为研究对象。收集NSCLC患者、良性肺部疾病患者的空腹静脉血，另收集NSCLC患者手术切除的癌组织和癌旁组织。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清及组织中的miR-1180的相对表达量。所有NSCLC患者均进行为期5年的随访，并统计其生存情况。结果 NSCLC患者血清miR-1180的相对表达量高于良性肺部疾病患者，差异有统计学意义(P < 0.05); 癌组织中miR-1180的相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P < 0.05)。NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量与性别、年龄、吸烟史、病理类型无关(P > 0.05), 与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关(P < 0.05)。血清miR-1180对NSCLC的辅助诊断价值较高，曲线下面积(AUC)为0.747, 95%CI为0.580~0.914, 准确度为0.754。miR-1180高表达患者的5年生存率低于miR-1180低表达患者，差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 miR-1180在NSCLC的血清和癌组织中均呈异常高表达，且其表达水平与肿瘤的恶性进展密切相关。miR-1180可作为NSCLC疾病诊断和预后评估的新型生物标志物。Abstract:Objective To investigate the expression of miR-1180 in serum and tissues of non-small cell lung cancer (NSCLC), and to analyze its relationship with clinicopathological characteristics and its value for disease diagnosis and prognostic evaluation.Methods Seventy-two patients with NSCLC and 50 patients with benign lung disease who received treatment at the same period were selected as the study subjects. Fasting venous blood of NSCLC patients and those with benign lung diseases was collected, and the cancer tissues and adjacent tissues were collected from NSCLC patients. Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the relative expression of miR-1180 in serum and tissues. All patients with NSCLC were followed up for 5 years, and their survival status was counted.Results The relative expression levels of miR-1180 in serum of the NSCLC patients were significantly higher than those in patients with the benign lung diseases (P < 0.05); the relative expression of miR-1180 in the cancer tissues was significantly higher than that in the adjacent tissues (P < 0.05). The relative expression of miR-1180 in serum and tissues of NSCLC patients was not correlated with gender, age, smoking history and pathological type (P > 0.05), but was related to tumor size, TNM stage, lymph node metastasis and degree of differentiation (P < 0.05). Serum miR-1180 had a high value in the auxiliary diagnosis of NSCLC, the area under the curve (AUC) was 0.747, the 95%CI was 0.580~0.914, and the accuracy was 0.754. The 5-year survival rate of patients with miR-1180 high expression was significantly lower than that of patients with low expression of miR-1180 (P < 0.05).Conclusion MiR-1180 is abnormally highly expressed in serum and cancer tissues of NSCLC, and its expression level is closely related to the malignant progression of tumors. MiR-1180 can be used as a new biomarker for diagnosis and prognostic evaluation of NSCLC.
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Keywords:
- non-small cell lung cancer /
- miR-1180 /
- diagnosis /
- prognosis /
- biomarkers /
- survival rate
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肺癌又称为原发性支气管肺癌，是中国及至全球范围内发病率排在首位的恶性肿瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)是其最常见的病理类型，占80%~85%[1]。由于NSCLC早期缺乏特异性症状，且其具有高侵袭和转移的特性，因此绝大多数患者在出现明确的症状就诊时已处于晚期，错失了手术治疗的最佳时机，导致患者的5年生存率普遍较低[2]。
目前，临床尚且缺乏有效诊断及评估NSCLC患者预后的生物标志物。多种微小RNA(miRNA)被证实可辅助NSCLC的早期诊断及预后评估，如miR-21、miR-33a等[3-4]。miR-1180是一种与多种恶性肿瘤密切相关的miRNA, 其在前列腺癌中可作为抑癌因子，抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5], 而肝癌中miR-1180则是作为促癌因子，促进肿瘤的恶性进展[6], 可见其在恶性肿瘤中发挥着双重作用。目前关于miR-1180和NSCLC的研究较少，尤其是作为潜在生物标志物在NSCLC的诊断和预后评估方面罕见报道。本研究检测了NSCLC血清及组织中miR-1180的表达情况，并探讨其与临床病理特征的关系及对疾病诊断和预后评估的价值，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2013年6月—2015年12月在中国人民解放军北部战区总医院接受治疗的NSCLC患者72例，其中男48例，女24例; 平均年龄(63.15±8.96)岁; 有吸烟史者52例，无吸烟史者20例; 病理类型为腺癌42例，鳞癌30例; 肿瘤大小 < 3 cm共40例, ≥3 cm共32例; TNM分期Ⅰ期15例，Ⅱ期29例，Ⅲ期28例; 淋巴结有转移32例，无转移40例; 分化程度为低分化24例，中分化33例，高分化15例。纳入标准: ①所有患者均经病理证实患有NSCLC; ②入组前未接受任何形式的抗肿瘤治疗者; ③未合并其他恶性肿瘤者; ④有完整的病例资料和随访资料者; ⑤患者自愿参与本次研究，对本次研究内容知情同意。排除标准: ① NSCLC复发者; ②合并有心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者; ③合并有精神疾病者; ④合并其他系统的感染性疾病者。
另选取同期接受治疗的良性肺部疾病患者50例，其中肺囊肿21例，间质性肺炎29例; 男35例，女15例; 平均年龄(62.18±7.94)岁; 有吸烟史者36例，无吸烟史者14例。NSCLC患者和良性肺部疾病患者的性别、年龄、吸烟史等资料比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。本研究已通过本院伦理委员会的批准。
1.2 方法
抽取所有研究对象的空腹静脉血5 mL, 离心后提取血清，将其置于低温环境下保存待测。另收集NSCLC患者手术切除的癌组织和癌旁组织，癌旁组织的定义为远离癌组织3 cm以上的非癌组织，放于液氮中冷冻保存待测。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测血清及组织中的miR-1180的相对表达量，加入Trizol试剂(北京索莱宝公司)提取总RNA, 采用微量分光光度计(美国Thermo公司, Nanodrop 2000)测定RNA浓度及纯度(A260/A280), 满意后采用逆转录试剂盒(大连宝生物有限公司)合成cDNA。
内参U6引物F: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, R: 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; miR-1180引物F: 5′-ACACTCCAGCTGGGTTTCCGGCTCGCGTGG-3′, R: 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。反应条件: 95 ℃ 5 s, 之后在以下环境中进行40个循环: 95℃ 5 s、72 ℃ 10 s。采用2-△△Ct法计算血清和组织中miR-1180的相对表达量。
所有NSCLC患者均进行为期5年的随访，每3个月至少进行1次随访，随访截止事件为患者死亡或随访时间结束，主要通过电话以及门诊复查的方式进行随访调查。根据NSCLC患者组织中miR-1180的表达量进行分组，高于或等于中位数的纳入到miR-1180高表达组(37例)，低于中位数的纳入到miR-1180低表达组(35例)。
1.3 统计学方法
使用SPSS 23.0进行统计学分析。miR-1180相对表达量等计量数据均通过正态性检验，以均值±标准差描述，采用t检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-1180对NSCLC的诊断价值。采用Kaplan-Meier乘积极限法生存曲线模型分析组织miR-1180相对表达量与预后的关系，组间生存率比较为Log-rank检验。统计推断的检验水准α=0.05(双侧检验)。P < 0.05为差异有统计学意义
2. 结果
2.1 NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量情况
miR-1180在NSCLC患者和良性肺部疾病患者血清中的相对表达量分别为(2.12±0.68)、(1.06±0.42), NSCLC患者血清miR-1180的相对表达量高于良性肺部疾病患者，差异有统计学意义(P < 0.05); miR-1180在癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为(2.65±0.73)、(1.24±0.54), 癌组织中miR-1180的相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(P < 0.05)。
2.2 NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量与一般资料及临床病理特征的关系
NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量与性别、年龄、吸烟史、病理类型无关(P > 0.05), 与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关(P < 0.05)。见表 1。
表 1 NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量与一般资料及临床病理特征的关系(x±s)临床病理参数 n 血清miR-1180 t P 组织miR-1180 t P 性别 0.350 0.727 0.163 0.871 男 48 2.14±0.72 2.66±0.75 女 24 2.08±0.61 2.63±0.71 年龄 0.667 0.507 0.625 0.534 < 60岁 33 2.06±0.63 2.59±0.70 ≥60岁 39 2.17±0.75 2.70±0.78 吸烟史 0.766 0.446 0.569 0.571 有 52 2.16±0.73 2.68±0.75 无 20 2.02±0.59 2.57±0.69 病理类型 0.124 0.902 1.079 0.284 腺癌 42 2.13±0.69 2.73±0.78 鳞癌 30 2.11±0.65 2.54±0.67 肿瘤大小 3.342 0.001 7.059 < 0.001 < 3 cm 40 1.89±0.56 2.08±0.57 ≥3 cm 32 2.41±0.76 3.36±0.89 TNM分期 4.195 0.000 7.051 < 0.001 Ⅰ、Ⅱ期 44 1.87±0.57 2.13±0.61 Ⅲ期 28 2.52±0.74 3.47±0.88 淋巴结转移 2.702 0.009 4.755 < 0.001 有 32 2.36±0.73 3.09±0.77 无 40 1.93±0.62 2.30±0.64 分化程度 3.028 0.003 3.894 < 0.001 低分化 24 2.46±0.72 3.12±0.81 中高分化 48 1.95±0.65 2.42±0.67 2.3 血清miR-1180相对表达对NSCLC的诊断价值分析
由前述分析知, NSCLC患者和良性肺部疾病患者血清miR-1180相对表达水平比较，差异有统计学意义(P < 0.05), 故进一步探讨其对NSCLC发生的诊断评估价值。以NSCLC患者为阳性样本(72例)，以良性肺部疾病患者为阴性样本(50例)，建立ROC诊断分析模型，分析显示，血清miR-1180相对表达对NSCLC具有较高的诊断价值，曲线下面积(AUC)为0.747, 95%CI为0.580~0.914, 准确度为0.754(92/122), 灵敏度为0.764(55/72), 特异度为0.740(37/50)。见表 2、图 1。
表 2 血清miR-1180相对表达对NSCLC的诊断价值分析结果指标 AUC(95%CI) 阈值 灵敏度 特异度 约登指数 准确度 miR-1180相对表达 0.747(0.580~0.914) 1.60 0.764 0.740 0.504 0.754 2.4 组织miR-1180与NSCLC患者预后的关系
随访5年结果显示, 72例NSCLC患者的5年生存率为40.28%(29/72)。miR-1180高表达组的5年生存率为24.32%(9/37), miR-1180低表达组的5年生存率为57.14%(20/35), miR-1180高表达组的5年生存率低于miR-1180低表达组(P < 0.05), 差异有统计学意义。见表 3、图 2。
表 3 NSCLC患者组织miR-1180高、低表达组的Kaplan-Meier生存期资料及比较[n(%)]组别 n 3年生存 5年生存 中位生存期/月 miR-1180高表达组 37 19(51.35) 9(24.32) 36 miR-1180低表达组 35 28(80.00) 20(57.14)* — 与miR-1180高表达组比较, *P < 0.05。 3. 讨论
据流行病学统计[7-9]显示，肺癌发病率呈逐年递增趋势，已成为影响人类生命健康的重要疾病。NSCLC是肺癌的主要类型，患者在初诊时通常已到中晚期，而目前的相关临床指南仅建议对TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期的患者进行外科手术根治性切除，同时也有少部分Ⅲ期可进行手术治疗，大部分Ⅲ~Ⅳ期的NSCLC患者预后情况不容乐观[10-12]。尽管目前临床可通过肿瘤标志物、计算机断层扫描、磁共振成像等方式对肺癌进行早期的筛查，但整体效果欠佳，且临床准确评估患者预后的方式较为有限，因此寻找与NSCLC相关的新型生物标志物具有重要的临床价值[13]。
相关研究[14]表明, miR-1180在肝癌细胞中呈高表达，且其可通过靶向调控分泌型卷曲相关蛋白1来促进转化生长因子β信号通路的激活，进而有效促进肝癌的迁移和侵袭。在胰腺癌中miR-1180依然发挥着促癌因子的作用，其可有效促进癌细胞的增殖、侵袭和迁移，而在抑制其表达后，癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显减弱[15]。GU Z W等[16]研究显示, miR-1180可增强卵巢癌的化疗耐药(抗顺铂)，且高表达的miR-1180与患者的预后不良密切相关。但miR-1180在不同恶性肿瘤中发挥的作用存在差异，其在部分恶性肿瘤中发挥抑癌因子的作用。miR-1180在膀胱癌细胞中呈低表达，且其可通过调控细胞周期相关蛋白的表达干扰细胞周期进程，抑制癌细胞增殖[17]。在前列腺癌中, miR-1180可靶向调节肿瘤坏死因子受体相关因子1以及核转录因子-κB信号通路，抑制癌细胞的恶性进展[5]。本研究结果显示, NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量均异常升高，且其表达水平升高与NSCLC的恶性进展密切相关，提示miR-1180在NSCLC中可能发挥着促癌因子的作用。CHEN E G等[18]研究显示, miR-1180在肺癌细胞中表达升高，且可通过靶向GSK-3β调控β-catenin信号通路，促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。另有研究[19]显示, miR-1180-3p在肺癌组织和肺癌细胞系(A549和H1975)中均表达上调。以上可能是miR-1180参与NSCLC恶性进展的作用机制之一，但目前关于miR-1180与肺癌的基础研究较少，其具体作用机制还有待更多的研究进行探索。
血清指标由于具有样本易获取、重复性好等特点，一直是术前无创诊断的重点研究对象。组织中的指标虽然可更好的反映病变情况，然而获取组织后可直接做病理检测，因此组织中的指标对于恶性肿瘤的诊断无实际的临床意义，但其在患者的预后评估方面具有重要的参考价值。鉴于此，本研究重点分析了血清miR-1180对NSCLC的诊断价值以及组织miR-1180对患者预后的评估价值。本研究结果显示，血清miR-1180对NSCLC的辅助诊断价值较高, AUC为0.747, 95%CI为0.580~0.914。此外, miR-1180高表达组的5年生存率显著低于miR-1180低表达组(P < 0.05)。这提示miR-1180可作为NSCLC疾病诊断和预后评估的新型生物标志物。但本研究选取的病例较少，且病例均来源于中国人民解放军北部战区总医院，未进行多中心的研究，这可能会导致研究结果出现一定的偏差，在后续的研究中将增加病例的数量和扩大地区范围，以得到更加准确、更有临床价值的结论。
综上所述，本文创新性地研究了miR-1180与NSCLC的关系，结果发现其在NSCLC的血清和癌组织中均呈异常高表达，且其表达水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移以及分化程度有关。血清miR-1180对NSCLC的辅助诊断价值较高，组织miR-1180的表达情况与患者的预后密切相关。miR-1180有望成为NSCLC的新型生物标志物。但目前关于miR-1180对NSCLC恶性进展的具体作用机制尚不明确，仍有待更多的基础研究进行更加深入的探索。
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表 1 NSCLC患者血清及组织中miR-1180的相对表达量与一般资料及临床病理特征的关系(x±s)
临床病理参数 n 血清miR-1180 t P 组织miR-1180 t P 性别 0.350 0.727 0.163 0.871 男 48 2.14±0.72 2.66±0.75 女 24 2.08±0.61 2.63±0.71 年龄 0.667 0.507 0.625 0.534 < 60岁 33 2.06±0.63 2.59±0.70 ≥60岁 39 2.17±0.75 2.70±0.78 吸烟史 0.766 0.446 0.569 0.571 有 52 2.16±0.73 2.68±0.75 无 20 2.02±0.59 2.57±0.69 病理类型 0.124 0.902 1.079 0.284 腺癌 42 2.13±0.69 2.73±0.78 鳞癌 30 2.11±0.65 2.54±0.67 肿瘤大小 3.342 0.001 7.059 < 0.001 < 3 cm 40 1.89±0.56 2.08±0.57 ≥3 cm 32 2.41±0.76 3.36±0.89 TNM分期 4.195 0.000 7.051 < 0.001 Ⅰ、Ⅱ期 44 1.87±0.57 2.13±0.61 Ⅲ期 28 2.52±0.74 3.47±0.88 淋巴结转移 2.702 0.009 4.755 < 0.001 有 32 2.36±0.73 3.09±0.77 无 40 1.93±0.62 2.30±0.64 分化程度 3.028 0.003 3.894 < 0.001 低分化 24 2.46±0.72 3.12±0.81 中高分化 48 1.95±0.65 2.42±0.67 
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表 2 血清miR-1180相对表达对NSCLC的诊断价值分析结果
指标 AUC(95%CI) 阈值 灵敏度 特异度 约登指数 准确度 miR-1180相对表达 0.747(0.580~0.914) 1.60 0.764 0.740 0.504 0.754
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表 3 NSCLC患者组织miR-1180高、低表达组的Kaplan-Meier生存期资料及比较[n(%)]
组别 n 3年生存 5年生存 中位生存期/月 miR-1180高表达组 37 19(51.35) 9(24.32) 36 miR-1180低表达组 35 28(80.00) 20(57.14)* — 与miR-1180高表达组比较, *P < 0.05。
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