Mechanism of long non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1 in the regulation of hepatocellular carcinoma progression and chemoresistance
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摘要:目的 探讨长链非编码RNA (LncRNA)肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)在调控肝细胞癌(HCC)的进程和化疗耐药中的潜在机制。方法 从接受手术的患者中收集20对HCC组织和邻近的非癌组织(距离癌组织 > 5 cm)。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MALAT1、miR-618和MAEL在肿瘤组织和HCC细胞系中的表达。采用生物信息学预测并通过荧光素酶测定法鉴定miR-618的上游和下游靶标。通过细胞活力分析MALAT1在HCC增殖中的功能, 通过侵袭和划痕实验分析MALAT1在HCC细胞侵袭和迁移中的作用。通过qRT-PCR和蛋白质印迹法分析MALAT1、miR-618和MAEL对HCC细胞上皮间质转化(EMT)的影响。通过MTT法和克隆形成试验验证MAEL的化疗耐药性。结果 与癌旁组织和肝细胞系比较, MALAT1和MAEL在肿瘤组织和HCC细胞系中呈高表达, miR-618呈低表达(P < 0.05)。双荧光素酶测定确定miR-618的上游和下游靶标分别是MALAT1和MAEL。沉默MALAT1、过表达miR-618或沉默MAEL的细胞增殖、侵袭和迁移能力降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。MALAT1通过靶向miR-618/MAEL调控肿瘤EMT过程。MAEL促进了肝癌对表阿霉素的耐药性。结论 LncRNA MALAT1可以通过竞争性结合miR-618调控MAEL的表达，从而影响HCC的进展和耐药性。EMT过程在LncRNA MALAT1调控HCC生物学功能中发挥重要作用，因此MALAT1可能是HCC的潜在治疗靶点。Abstract:Objective To explore the potential mechanism of long non-coding RNA (LncRNA) metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1) in the progression of hepatocellular carcinoma (HCC) and chemotherapy resistance.Methods This study included 20 pairs of tissues including HCC tissues and adjacent non-cancerous tissues (> 5 cm from cancerous tissues) from patients who underwent surgeries. The expressions of MALAT1, miR-618 and MAEL in tumor tissues and HCC cell lines were detected by fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). The upstream and downstream targets of miR-618 were predicted by bioinformatics and identified by luciferase assay. The function of MALAT1 in the proliferation of HCC was analyzed by cell viability, and the function of MALAT1 in HCC cell invasion and migration were studied by the analysis of invasion and scratch experiments. The effects of MALAT1, miR-618 and MAEL on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of HCC cells were analyzed by qRT-PCR and western blotting. MAEL's chemotherapy resistance research was verified by MTT method and clone formation assay.Results Compared with adjacent tissues and liver cell lines, MALAT1 and MAEL were highly expressed in tumor tissues and HCC cell lines, and miR-618 was lowly expressed (P < 0.05). The dual luciferase assay determined that the upstream and downstream targets of miR-618 were MALAT1 and MAEL, respectively. The proliferation, invasion and migration of cells silencing MALAT1, overexpression of miR-618 or silencing MAEL decreased, the difference was statistically significant (P < 0.05). BMALAT1 regulated tumor EMT process by regulating miR-618/MAEL. MAEL promoted HCC resistance to epirubicin.Conclusion LncRNA MALAT1 can regulate the expression of MAEL by competitively binding miR-618 to affect HCC progression and drug resistance. The EMT process plays an important role in the regulation of HCC biological functions by LncRNA MALAT1, which suggests that MALAT1 may be a potential therapeutic target for HCC treatment.
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肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤之一，被认为是癌症相关死亡的第3大常见原因[1]。研究[2]显示, HCC在全球范围内的发病率逐渐升高, HCC的病因和分子机制复杂，其发生可能与上皮-间质转化(EMT)有关。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度为200~1 000 nt的非编码RNA[3], 目前已有多种LncRNA已被发现在人体组织及疾病中异常表达，并被认为在癌症的发病和进展中发挥重要作用[4]。研究[5]表明, LncRNA通过参与细胞增殖、分化等生物学过程影响肿瘤的发生和发展。LncRNA肺腺癌转移相关转录本1(MALAT1)位于11号染色体，研究[6]表明, MALAT1在许多肿瘤中呈异常表达，但MALAT1在HCC进展和化疗耐药中的生物学机制仍然未知。本研究通过临床样本和细胞实验验证LncRNA MALAT1在HCC进程中的作用，为HCC的分子标志物的筛选和靶向治疗提供支持。
1. 材料与方法
1.1 临床资料
本研究收集2018年1月—2020年12月接受手术患者的20对组织，包括HCC组织和邻近的非癌组织(距离癌组织>5 cm), 患者术前未进行全身治疗。纳入标准: 所有样本均经组织病理学活检诊断为HCC, 所有胰腺导管腺癌(PDAC)患者术前均未接受放疗和化疗或其他治疗，患者依从性较好。排除其他恶性疾病患者，经过放化疗治疗的患者及依从性较差的患者。所有收集的组织样本均储存在-80 ℃。本研究经医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。
1.2 细胞培养及转染分组情况
HCC细胞系HLE、BEL7402、QGY7701和SMMC7721以及人正常肝细胞系MIHA均购自北京北纳生物。将细胞放在含有10%胎牛血清和1%双抗(青霉素-链霉素)的RMI-1640培养基后培养在5% CO2和37 ℃的湿度为66%的培养箱中培养。miR618模拟物和miR618抑制剂购自上海吉玛基因。本研究构建的Sh-MALAT1的碱基序列为5′-CACCGCAGCCCGAGACTTCTGTAAACGAATTTACAGAAGTCTCGGGCTGC-3′; Sh-MAEL的碱基序列为5′-CACCGCCTGAGCGAGCAGAATTACTACGAATAGTAATTCTGCTCGCTCAGG-3′。通过Lipofectamine 2 000将MALAT1、Sh-MALAT1、miR-618模拟物、miR-618抑制剂、MAEL和Sh-MAEL转染至HCC细胞系。
本研究根据研究目的分为空白组(Black组)、空载体组(Empty vector组)、过表达MALAT1组(pc-MALAT1组)、MALAT1抑制组(Sh-MALAT1组)、miR-618过表达组(miR-618 mimics组)、miR-618抑制组(miR-618 inhibitor组)、miR-618+pc-MALAT1共转染组(miR-618 mimic+pc-MALAT1组)、MALAT1-wt组[野生型(WT)MALAT1]及MALAT1-mut组[突变型(mut)MALAT1]。溶剂对照组(Control组)、阿霉素组(EPI组)、阿霉素+MAEL抑制组(EPI+Sh-MAEL组)和阿霉素+MAEL过表达组(EPI+pc-MAEL组)，每组6个样本。
1.3 细胞活力(MTT)检测
HCC细胞在66孔板中培养，分别处理4、24、48、60 h。使用MTT试剂盒(Promega, 美国)评估细胞活力，并使用酶标仪(Thermo, 美国)在460 nm处测量吸光度(OD)。
1.4 克隆形成试验
转染24 h并继续培养10 d后，将细胞转移到带有生长培养基的六孔板中。固定并用0.5%结晶紫染色后计算克隆形成数。克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数×100%。
1.5 细胞侵袭实验和伤口愈合测试
对数期的HCC细胞悬浮于无血清培养基中，并接种到Transwell小室，下室充满了含有10%胎牛血清的培养基。Transwell小室在37 ℃下转移到含有5% CO2的培养环境中。16 h后，用多聚甲醛固定HCC细胞，在光学显微镜下计数。
将转染相应质粒的HCC细胞系接种在六孔板中，用100 μL枪头用于划痕处理。划痕处理后的即刻和12 h采用相差显微镜拍摄划痕宽度。
1.6 双荧光素酶报告基因检测
突变型(mut)或野生型(WT)LncRNA MALAT1的3′UTR插入到pMir-Target质粒(Origene, 美国)的萤火虫荧光素酶基因中。添加pRL-TK作为内参，人胚肾263细胞(HEK-263T)同时转染pMir-Firefly-MALAT1 3′UTR(50 ng)、pRL-TK(10 ng)和miR-618模拟物或阴性对照。转染48 h后，根据说明采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, 美国)分别检测Firefly和Renilla的荧光素酶活性。最后，计算萤火虫荧光素酶荧光强度与海肾荧光素酶荧光强度的比值，并将其作为相对荧光素酶活性。
1.7 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从培养细胞和肝组织中提取总RNA。通过PrimeScriptⓇ1st Strand Synthesis Kit(TaKaRa, Tokyo, Japan)将RNA转化为cDNA。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas, USA)进行qRT-PCR。相对定量采用2-ΔΔCt 方法计算，以GAPDH为内参计算RNA的相对表达量，引物序列如下。MALAT1上游: 5′-GACGGAGGTTGAGATGAAGC-3′; miR-618上游: 5′-AACTCTACTTGTCCTTCTG-3′; MAEL上游: 5′-TTGCTGATGCCATCCCTTACT-3′; E-钙黏蛋白(E-Cadherin)上游: 5′-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3′; GAPDH上游: 5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′。MALAT1下游: 5′-ATTCGGGGCTCTGTAGTCCT-3′; miR-618下游: 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACACTCAG-3′; MAEL下游: 5′-AGCTGACATATCTGGAGGTGAA-3′; E-Cadherin下游: 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′; GAPDH下游: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3′。
1.8 蛋白质印迹法
采用带有蛋白酶抑制剂混合物(Abmole，美国)的RIPA缓冲液从细胞中提取蛋白质。通过二辛可宁酸法(Waltham, 美国)计算蛋白质样品。等量的80 μg样品在10.5% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，转移到PVDF膜上，然后在室温下用8%脱脂牛奶封闭。将PVDF膜与一抗一起孵育: 抗MAEL、和抗β-actin(1∶800; Abcam, 美国)在4 ℃下过夜然后使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶2 000, Abcam) 在37 ℃下孵育1 h后进行检测。
1.9 统计学分析
本研究采用Excel软件进行数据录入，计数资料以平均值±标准差表示。利用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad Software, 美国)完成统计分析，采用独立样本t检验进行组间比较，单因素和双因素方差分析(one or two-way ANOVA)进行组间差异比较, Tukey's法用于组间两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 MALAT1、miR-618和MAEL在HCC组织和细胞中的表达
与癌旁组织比较, HCC组织中MALAT1和MAEL的表达均增加，但miR-618的表达降低，差异有统计学意义(P < 0.01)。与MIHA细胞比较, MALAT1和MAEL在不同HCC细胞系中高表达, miR-618呈低表达，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 1。
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图 1 MALAT1、miR-618和MAEL在HCC组织和细胞系中的表达A: HCC组织中MALAT1、miR-618和MAEL的相对表达情况(每组20个样本); B: MALAT1、miR-618和MAEL在
肝细胞和不同HCC细胞系中的表达(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01。2.2 MALAT1对HCC细胞增殖的作用
为了研究MALAT1是否与HCC中的细胞增殖有关，本研究将pcDNA-MALAT1或Sh-MALAT1转染到QGY7701和SMMC7721细胞中分别增加和减少MALAT1的表达。MALAT1表达在pcDNA-MALAT1转染细胞中上调，在Sh-MALAT1转染细胞中下调。MTT分析显示, MALAT1过表达能够促进细胞增殖，而当MALAT1被抑制时，细胞增殖能力下降，这一现象在克隆形成实验中得到了同样证实(P < 0.01), 见图 2。
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图 2 MALAT1显著促进HCC中的细胞增殖A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的相对表达水平; B: MTT检测用于检测pcDNA-MALAT1或Sh-MALAT1转染的
SMMC-7721和QGY-7701细胞的细胞活力; C: 进行克隆形成测定以阐明QGY-7701和SMMC-7721细胞的生长(每组6个样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.3 MALAT1促进HCC细胞的侵袭和迁移
为了确定MALAT1在HCC细胞侵袭和迁移中的作用，将细胞分为4组: 空载体组、空白对照组、pcDNA-MALAT1转染组和Sh-MALAT1转染组。Transwell侵袭实验和划痕实验表明，转染细胞的侵袭和迁移能力显著增加。MALAT1敲低的细胞系的侵袭/迁移能力降低，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 3。
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图 3 QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验和划痕试验A: QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验。B: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6个样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.4 MALAT1与miR-618的靶向性验证
本研究通过生物信息学预测miR-618可能是MALAT1的下游靶点。进一步采用双荧光素酶报告基因检测以验证miR-618和MALAT1的靶向关系，结果表明，转染miR-618模拟物能够抑制MALAT1-wt组的荧光素酶活性，差异有统计学意义(P < 0.01), 但对MALAT1-mut组的荧光素酶活性无显著影响。克隆形成实验中, miR-618过表达组克隆形成数降低，而miR-618抑制剂组显著升高，与MALAT1结果相反。当miR-618模拟物和MALAT1共转染时，克隆形成数高于Empty vector组，见图 4。
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图 4 MALAT1与miR-618的靶向性关系A: MALAT1和双荧光素酶报告基因检测上的miR-618结合位点; B: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达情况;
C: QGY-7701和SMMC-7721的细胞集落数(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.5 miR-618对HCC细胞的侵袭和迁移的作用
miR-618显著抑制了HCC细胞的侵袭，而MALAT1可以逆转这一过程。siRNA对miR-618的抑制作用能够显著促进迁移，而miR-618模拟物导致HCC迁移能力降低，差异有统计学意义(P < 0.01), 而这一现象可以被MALAT1所逆转，见图 5。
2.6 MiR-618通过MAEL的表达调控HCC的增殖和侵袭
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图 5 MiR-618抑制HCC细胞的侵袭和迁移A: QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验; B: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6例样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。通过TragetScan预测miR-618的靶基因结果发现, MAEL是通过3′UTR的相互作用抑制靶点。MAEL的荧光素酶活性因野生型中miR-618的过表达而显著降低，但在突变型中无显著变化。此外, qRT-PCR检测MAEL的表达显示, MAEL在QGY7701和SMMC7721细胞中过表达，且过表达被miR-618模拟物下调。此外，转染特异性靶向MAEL的siRNA后, MAEL的表达降低。蛋白质印迹分析显示, MAEL的表达也降低，见图 6。
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图 6 MiR-618与MAEL靶向调控验证A: 生物信息学预测MAEL和双荧光素酶报告基因检测上的miR-618结合位点; B: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达; C: 蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达(每组6个样本)。
**P < 0.01, ***P < 0.001, ***P < 0.001。采用MTT测定和克隆形成测定进一步研究MAEL在细胞增殖、迁移和HCC侵袭中的功能。MTT测定和克隆形成测定结果表明, MAEL过表达的HCC细胞显著促进细胞增殖, MAEL和miR-618模拟物的共转染可以抑制MAEL过表达增强的细胞增殖。此外, MAEL敲低并抑制了HCC细胞增殖(P < 0.01)。侵袭试验表明，增强MAEL表达加速了HCC细胞的侵袭，相反siRNA对MAEL的抑制显著抑制了HCC细胞侵袭。转染MAEL和miR-618模拟质粒的HCC细胞与空白组、空载体组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。划痕试验表明，通过转染的HCC细胞中的MAEL表达质粒增加, MAEL表达促进了QGY7701和SMMC7721细胞的迁移，而过表达miR-618抑制细胞迁移距离，抑制MAEL后HCC细胞迁移能力被抑制，见图 7。
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图 7 MAEL对细胞增殖、迁移和侵袭的作用A: MTT测定法检测pcDNA-MALAT1或Sh-MALAT1转染的QGY-7701和SMMC-7721细胞的细胞活力;
B: QGY-7701和SMMC-7721细胞集落数; C: QGY-7701和SMMC-7721的侵袭试验;
D: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。2.7 MALAT1促进HCC中的EMT进程
qRT-PCR显示, E-cadherin的转录水平降低，而波形蛋白的转录水平在过表达的MALAT1中增加，差异有统计学意义(P < 0.01)。E-钙黏蛋白表达增强，波形蛋白被MALAT1抑制。蜗牛蛋白的表达比较无显著变化(图 8A)。蛋白质印迹法表明，增强MALAT1显著降低了E-cadherin的表达，并增加了波形蛋白和蜗牛蛋白的表达。Sh-MALAT1组中，波形蛋白和蜗牛蛋白的蛋白质表达显著受到抑制，而E-钙黏蛋白显著增强(图 8B)。
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图 8 MALAT1促进HCC的EMT进程A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白表达情况;
B: 通过蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01。2.8 MiR-618通过调控MAEL影响肿瘤EMT进程
HCC细胞中MAEL的过表达抑制了E-钙黏蛋白的表达，另一方面，促进了波形蛋白的表达。相反, HCC细胞系抑制MAEL的表达后能够显著增加E-钙黏蛋白的表达，并降低波形蛋白的表达。与对照组比较，蜗牛蛋白的表达水平相同。miR-618的过表达通过MAEL促进了E-cadherin的表达并抑制波形蛋白的表达。Western blot结果显示, MALAT1表达增强的HCC细胞E-cadherin表达显著降低，而波形蛋白和蜗牛蛋白表达显著增加。抑制MAEL后HCC细胞E-钙黏蛋白表达升高而波形蛋白和蜗牛蛋白表达降低(图 9)。
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图 9 MiR-618通过调控MAEL影响肿瘤EMT进程A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达情况; B: 通过蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达(每组6个样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01。2.9 MAEL促进HCC的耐药性
接下来本研究观察了MAEL是否影响HCC的耐药性。MTT分析显示，表阿霉素(EPI)可抑制HCC细胞的活力。与EPI处理的HCC细胞比较, EPI处理的HCC细胞中的过表达MAEL能够减弱EPI的治疗效果(图 10A)。此外，克隆形成分析表明，与空白组和对照组比较, MAEL过表达的HCC细胞形成了更多的细胞集落(图 10B)。总的来说，这些结果证实了MAEL能够促进HCC细胞的耐药性。
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图 10 MAEL促进了HCC的耐药性A: MTT测定法检测EPI处理的QGY-7701和SMMC-7721细胞的细胞活力; B: 克隆形成测定阐明QGY-7701和SMMC-7721细胞的生长(每组6例样本)。**P < 0.01, ***P < 0.001。3. 讨论
越来越多的报道[7]表明, LncRNA在包括HCC在内的癌症的进展和转移中发挥着重要作用，且LncRNA可以作为肿瘤诊断和预后的生物标志物[8]。本研究发现, MALAT1在HCC组织中的表达高于癌旁组织，在人肝癌细胞系中的表达也增加。功能研究结果表明, MALAT1促进了HCC细胞的增殖、侵袭和迁移，说明MALAT1在HCC进展中的扮演着重要角色。
LncRNA表达调控为疾病的治疗提供了一个新的方向。研究[6]表明，尿液中的miRNA可能是HCC早期诊断的潜在生物标志物。在LncRNA与miRNA的相关性研究中, LncRNA通常调节miRNA的表达和活性。目前，报道未发现MALAT1和miR-618与HCC的关系。为了确定这个问题，本研究使用了生物信息学知识预测MALAT1的下游靶基因可能是miR-618, 并通过双荧光素酶报告基因检测进行验证。
上皮-间充质转化(EMT)是一种病理过程，特征为上皮细胞转分化为可移动的间充质细胞，并与癌症进展有关[9-13]。证据[14-15]表明, MAEL和EMT在癌症(包括HCC)中存在显著相关性, MAEL表达通过诱导EMT影响结直肠癌的细胞增殖和侵袭能力。本研究将MAEL确定为miR-618的靶标，此外发现HCC组织和HCC细胞系中的MAEL表达增加，说明MAEL通过粘附连接诱导EMT以促进HCC进展。
表阿霉素(EPI)是一种全球性的癌症治疗化疗药物，通过触发耐药性诱导自噬，从而阻止癌细胞通过[16]。本研究发现, MAEL可以使用EPI促进HCC的增殖，表明MAEL可以通过激活黏附连接途径增加肝癌细胞的化疗抗性。因此, MALAT1可能是HCC的致癌基因，可以通过miR-618/MAEL轴促进HCC的进展和化疗抗性。MALAT1可能是HCC的潜在治疗靶点，为未来的靶向治疗提供可靠数据。
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图 1 MALAT1、miR-618和MAEL在HCC组织和细胞系中的表达
A: HCC组织中MALAT1、miR-618和MAEL的相对表达情况(每组20个样本); B: MALAT1、miR-618和MAEL在
肝细胞和不同HCC细胞系中的表达(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01。![]()
图 2 MALAT1显著促进HCC中的细胞增殖
A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的相对表达水平; B: MTT检测用于检测pcDNA-MALAT1或Sh-MALAT1转染的
SMMC-7721和QGY-7701细胞的细胞活力; C: 进行克隆形成测定以阐明QGY-7701和SMMC-7721细胞的生长(每组6个样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。![]()
图 3 QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验和划痕试验
A: QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验。B: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6个样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。![]()
图 4 MALAT1与miR-618的靶向性关系
A: MALAT1和双荧光素酶报告基因检测上的miR-618结合位点; B: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达情况;
C: QGY-7701和SMMC-7721的细胞集落数(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。![]()
图 5 MiR-618抑制HCC细胞的侵袭和迁移
A: QGY-7701和SMMC-7721的Transwell侵袭试验; B: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6例样本)。
*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。![]()
图 6 MiR-618与MAEL靶向调控验证
A: 生物信息学预测MAEL和双荧光素酶报告基因检测上的miR-618结合位点; B: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达; C: 蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中MALAT1的表达(每组6个样本)。
**P < 0.01, ***P < 0.001, ***P < 0.001。![]()
图 7 MAEL对细胞增殖、迁移和侵袭的作用
A: MTT测定法检测pcDNA-MALAT1或Sh-MALAT1转染的QGY-7701和SMMC-7721细胞的细胞活力;
B: QGY-7701和SMMC-7721细胞集落数; C: QGY-7701和SMMC-7721的侵袭试验;
D: QGY-7701和SMMC-7721的划痕试验(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。![]()
图 8 MALAT1促进HCC的EMT进程
A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白表达情况;
B: 通过蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达(每组6个样本)。*P < 0.05, **P < 0.01。![]()
图 9 MiR-618通过调控MAEL影响肿瘤EMT进程
A: QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达情况; B: 通过蛋白质印迹分析检测QGY-7701和SMMC-7721细胞系中E-钙黏蛋白、波形蛋白和蜗牛蛋白的表达(每组6个样本)。
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