Effect of luteolin on the proliferation, apoptosis and Hippo/Yes-related protein pathway of lung epithelial cells induced by bleomycin
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摘要:目的 探究木犀草素（Lut）对博来霉素（BLM）诱导的人肺正常上皮细胞（BEAS-2B细胞）增殖、凋亡及Hippo/Yes相关蛋白（YAP）通路的影响。方法 体外培养BEAS-2B细胞，使用4、8、12、24 μg/mL BLM诱导12、24、48 h，筛选BLM诱导浓度和时间。将BEAS-2B细胞分为对照组、BLM组以及Lut低、中、高浓度组。各组细胞培养24 h后，倒置显微镜观察细胞形态学变化；采用CCK-8法检测细胞增殖能力；采用流式细胞术检测细胞凋亡率；采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Hippo/YAP通路相关蛋白-哺乳动物STE20样蛋白激酶1（MST1）、大肿瘤抑制因子1（LAST1）和YAP磷酸化水平。结果 BLM诱导24 h后BEAS-2B细胞的半数抑制浓度（IC50）约为8 μg/mL，所以本研究选取8 μg/mL BLM诱导细胞24 h。与对照组相比，BLM组细胞较小，边缘不规则，细胞间隙增加，细胞增殖能力、MST1、LAST1和YAP蛋白磷酸化水平显著降低（P < 0.05），凋亡率显著升高（P < 0.05）；与BLM组相比，Lut低、中、高浓度组细胞形态趋于正常，细胞增殖能力、MST1、LAST1和YAP磷酸化水平依次升高（P < 0.05），凋亡率依次降低（P < 0.05）。结论 Lut可能通过激活BEAS-2B细胞中Hippo/YAP信号通路，提高BLM诱导后细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡。Abstract:Objective To explore the effect of luteolin(Lut)on the proliferation, apoptosis and the Hippo/Yes-related protein (YAP) pathway of human lung epithelial cell (BEAS-2B cells) induced by bleomycin(BLM).Methods BEAS-2B cells were cultured in vitro, and induced with 4, 8, 12 and 24 μg/mL BLM for 12, 24 and 48 h, respectively, to determine the BLM induction concentration and time. The BEAS-2B cells were divided into control group, BLM group, and Lut low, medium and high concentration groups. After 24 hours of cell culture in each group, the morphological changes of the cells were observed with an inverted microscope; the cell proliferation ability was detected by the CCK-8 method; the rate of cell apoptosis was detected by flow cytometry; Western blot was used to detect Hippo/YAP pathway related proteins-mammalian Sterile20-like 1(MST1), the large tumour suppressor 1 (LAST1) and YAP phosphorylation levels.Results The half maximal inhibitory concentration (IC50) of BEAS-2B cells after 24 hours of BLM induction was about 8 μg/mL, so 8 μg/mL BLM was selected to induce cells for 24 hours. Compared with the control group, the BLM group had smaller cells, irregular edges, increased intercellular space, the cell proliferation ability, MST1, LAST1 and YAP phosphorylation levels significantly decreased, and apoptosis rate significantly increased (P < 0.05); compared with the BLM group, the cell morphology of the Lut low, medium, and high concentration groups tended to be normal, and the cell proliferation ability, MST1, LAST1 and YAP protein phosphorylation levels increased successively (P < 0.05), and the rate of apoptosis decreased successively (P < 0.05).Conclusion Lut may activate the Hippo/YAP signaling pathway in BEAS-2B cells, increase the proliferation of BEAS-2B cells induced by BLM, and inhibit cell apoptosis.
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Keywords:
- luteolin /
- bleomycin /
- lung epithelial cells /
- Hippo/Yes-associated protein pathway /
- proliferation /
- apoptosis
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近年来，内镜黏膜下剥离术(ESD)已成为早期食管癌及食管癌前病变的首选治疗方法[1-3], 但ESD后狭窄则是困扰手术医生的难题。本研究在治疗过程中应用Hook刀对狭窄部位行内镜下放射状切开术(ERI)治疗，取得了满意的疗效，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2017年11月—2021年2月苏北人民医院收治的食管ESD后狭窄患者11例为研究对象，均行ERI治疗，其中男7例，女4例，年龄62~81岁，平均(69.1±6.2)岁。纳入标准: ①根据病史、临床表现、胃镜检查证实为ESD后狭窄者; ②钡餐或碘剂造影显示狭窄病变长度<5.0 cm, 且为单一狭窄段; ③切开术前曾接受≥3次的扩张或其他治疗、治疗无效或短期内复发者[4-6]; ④完善术前检查及生化、凝血常规、影像学检查者，术前未长期服用抗凝药者，无手术绝对禁忌证者。排除标准: ①合并严重心肺疾病者及存在脏器功能衰竭者; ②身体状况不能耐受手术者。
1.2 手术相关设备
Olympus 290主机及Olympus Q260J治疗内镜, KD-620-LR型Hook刀, FD-1U-1热活检钳, ERBE ICC-200高频电切装置, CO2气泵系统，南京微创ROCC-D-26-195和谐夹。ERBE ICC-200高频电切装置参数: ①内镜电切采用Q模式，效果3、宽度2、间隔4, 功率45 W; ②采用强力电凝模式，效果2, 功率50 W[7]。
1.3 患者围术期护理、内镜操作及配合
1.3.1 术前护理
拟行手术的患者基本都经历过多次内镜下治疗，患者对手术存在恐惧、焦虑等情况，护理人员应充分向患者讲解手术的目的以及术后可能获得的收益; 当发生并发症时，应采取积极的措施以消除患者的恐惧感、紧张感，使患者能在良好的状态下接受手术。患者术前完善入院常规检查，签署内镜治疗同意书，嘱咐患者术前禁食8 h、禁水4 h, 详细询问患者是否仍在服用抗凝药物，为避免术后迟发性出血，应停药5 d后再行手术。
1.3.2 术中护理
核对患者信息，协助患者取左侧屈膝位，连接监护仪以及吸氧、负压吸引装置，连接内镜治疗的各种器械设备。手术全程在静脉麻醉下(丙泊酚联合依托咪酯)进行。
1.3.3 术中操作配合
手术医生在内镜直视下进入食管腔内，到达狭窄部位后使用注水泵灌注灭菌注水用水，充分清洗管腔，观察狭窄部位形态，充分评估后采用Hook刀在内镜直视下沿狭窄部位纵轴推进切开疤痕，深度以切口底端到达口侧及肛侧正常食管黏膜连线构成的虚线水平或达固有肌层表层为佳。切开过程中，器械护士应始终保持Hook刀头朝向食管腔内，术中注意协助医生观察有无局部活动性出血及穿孔等，少量出血可予以热活检钳电凝止血。密切观察患者生命体征的变化情况，包括血压、心率、血氧饱和度、气道压以及颈部皮下气肿等。
1.3.4 术后护理
① 术毕时患者入复苏室，观察其神志，监测患者生命体征。待患者完全清醒后送回病房。患者取半卧位，连接心电监护仪并吸氧。嘱患者绝对卧床休息，变换体位要轻柔。②术后24 h内绝对禁食，可服用医嘱给予的硫糖铝混悬液及康复新液，保护局部黏膜，避免胃酸反流烧灼创面; 24 h后若无明显不适及并发症，可指导患者进食少量温流质饮食; 48 h后可进食半流质饮食; 72 h后可进食少渣软食，忌辛辣、刺激性饮食，减少食物对创面的刺激。③遵照医嘱给予患者抑酸剂、止血药物、黏膜保护剂治疗，术后24 h内给予适量补液治疗，随着进食改善可减少补液量。加强病房巡视，密切观察患者有无药物不良反应。④患者术后可能出现咽部不适、疼痛等症状，考虑为手术过程中内镜反复出入而摩擦咽部导致，一般无需特殊处理可自行好转，部分症状严重者可给予康复新液含漱。患者可能出现胸痛症状，考虑为术后创面疼痛，绝大多数症状较轻，可不予处理; 疼痛严重而影响睡眠者，可给予小剂量消炎痛栓塞肛以缓解症状。若患者出现呕吐症状，需注意观察呕吐物性质，若为咖啡色液体，除考虑术中少量出血由胃内反流呕出外，还需注意是否存在术后迟发性渗血; 若呕吐物为鲜红色血液，应考虑术后迟发性出血可能，应立即向医生汇报，必要时行内镜下止血治疗。若患者出现心率加快、血氧饱和度下降、颈部皮下气肿或呼吸困难时，应立刻考虑穿孔的可能，立即向医生汇报，同时完善术前准备，及早开展手术治疗。⑤根据患者的学历、知识水平、理解能力采取有针对性的出院指导，嘱咐患者避免进食干硬、辛辣、刺激性食物，以少渣软食为主，少食多餐。若进餐过程中突然出现进食梗阻症状，应立即来院行内镜下检查。⑥建立ERI患者档案，出院后1周回访患者恢复情况，并做好记录。术后1、3、6个月通知患者来院复查胃镜。
1.4 观察指标
评估患者手术前后吞咽困难的改善情况，采用吞咽困难评分表进行评估, 0分为正常进食, 1分为可进食部分固体, 2分为半流质饮食, 3分为只能进食液体, 4分为完全不能进食[6], 评估时点为ERI术前、术后5 d以及术后3、6个月。记录患者的手术时间、出血和穿孔情况以及术后因疼痛需药物治疗情况。
1.5 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，不同时点比较采用F检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
11例患者均成功完成ERI, 平均狭窄长度为(2.72±1.48) cm, 平均手术时间为(25.45±16.00) min; 2例患者出现术中渗血，经热活检钳止血成功; 4例患者术后有胸骨后隐痛，未使用镇痛药物治疗, 48~72 h后自行缓解。11例患者均未出现严重胸痛、感染、迟发性出血、穿孔、食管瘘或中转外科手术治疗等情况。术后随访6~24个月，平均13.9个月，所有患者吞咽困难症状较术前好转，见表 1。
表 1 11例患者手术前后狭窄处直径及吞咽困难评分比较(x±s)时点 狭窄处直径/cm 吞咽困难评分/分 ERI术前 0.34±0.14 3.09±0.54 术后5 d 1.26±0.19 1.18±0.60 术后3个月 1.16±0.22 1.45±0.69 术后6个月 1.14±0.20 1.80±0.98 F 19.190 18.970 P <0.001 <0.001 3. 讨论
研究[8-10]表明，若食管剥离面积超过3/4环周, ESD后食管狭窄发生率可高达66%~90%; 若食管剥离面积为全环周, ESD后食管狭窄发生率几乎为100%[11-12]。食管黏膜剥离长度>3.0 cm也是导致食管狭窄的危险因素[13]。目前, ESD后食管狭窄的机制仍不明确，考虑与黏膜切除后缺损部位的炎性反应以及愈合过程中的疤痕组织增生、纤维化有关[14], 其中疤痕组织增生、纤维化是导致食管ESD后狭窄的主要原因[15-16]。临床上治疗ESD后狭窄的方法包括内镜下药物注射(糖皮质激素或丝裂霉素)、球囊扩张、探条扩张等，而本研究采用的ERI治疗食管ESD后狭窄取得了良好的疗效。
ESD后疤痕狭窄导致的组织纤维化使术中无法有效进行黏膜下注射，因此使用Hook刀切开的过程中风险会更大，不仅需要医生能熟练掌握ESD操作技术，而且还需要护士的操作配合。护士需提前设置好适当的电外科参数，术中时刻注意掌握Hook刀的出刀方向，根据手术医生的要求变换不同的角度，一般以刀头方向朝向食管腔，避免刀头反向损伤食管肌层而导致穿孔的发生; 注意观察术中有无出血表现，若为少量渗血，可予以8%去甲肾上腺素液冲洗; 若为小血管渗血，可予以Hook刀弓部电凝止血; 若为小动脉搏动性出血，则需立即换用热活检钳找准出血血管断端充分电凝; 搏动性出血多迅猛，护士需要反应迅速并妥善操作处理。此外，还需观察患者生命体征的变化，若发现颈部皮下气肿、气道压增高且持续存在，应立即提醒手术医生患者存在穿孔的可能，尽早发现穿孔部位，并立即予以钛夹夹闭。
规范的围术期护理能提高患者手术安全性，术前护理应充分了解患者有无手术禁忌证、有无使用抗凝药物等可能导致术后迟发性出血的因素，而完善的术前心理护理能让患者及家属充分了解手术的收益，促使患者以平和的心态完成手术。术后应安排适宜的体位，采取半卧位，床头抬高30~45 °, 以防止胃酸反流损伤手术创面。医护还应指导患者饮食，术后24 h后可进食温流质饮食, 48 h后进食半流质饮食, 72 h后可进食少渣软食。严密观察患者的生命体征变化及病情的改变，及早发现并识别并发症，加强心理疏导，积极实施健康教育，随时根据患者病情调整宣教内容，术后持续跟踪调查，减少疾病复发，促进患者康复。
综上所述, ERI用于食管ESD后狭窄的治疗是安全有效的，术中医护间的默契配合能提高患者手术安全性，围术期规范护理则能促进患者康复。
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图 1 Lut对BLM诱导的BEAS-2B细胞形态的影响(放大倍数100倍)
A: 对照组; B: BLM组; C: Lut低浓度组; D: Lut中浓度组; E: Lut高浓度组。
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图 3 Lut对BLM诱导的BEAS-2B细胞MST1、LAST1和YAP磷酸化水平的影响
A: 对照组; B: BLM组; C: Lut低浓度组; D: Lut中浓度组; E: Lut高浓度组。
表 1 各浓度BLM诱导不同时间后BEAS-2B细胞存活率比较(n=6)(x±s)
BLM浓度 细胞存活率/% 12 h 24 h 48 h 4 μg/mL 71.78±0.95 57.41±0.25 30.82±0.22 8 μg/mL 59.79±0.37* 49.61±0.31* 25.45±0.43* 12 μg/mL 41.35±0.96*# 30.85±0.27*# 17.97±0.31*# 24 μg/mL 33.23±0.37*#△ 20.32±0.23*#△ 11.31±0.20*#△ 与同时点4 μg/mL浓度比较, *P < 0.05; 与同时点8 μg/mL浓度比较, #P < 0.05;
与同时点12 μg/mL浓度比较, △P < 0.05。
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表 2 各组BEAS-2B细胞MST1、LAST1和YAP磷酸化水平比较(x±s)
组别 n p-MST1/MST1 p-LAST1/LAST1 p-YAP/YAP 对照组 6 0.87±0.09 0.92±0.11 0.95±0.10 BLM组 6 0.22±0.03* 0.19±0.02* 0.27±0.03* Lut低浓度组 6 0.52±0.06# 0.43±0.05# 0.55±0.06# Lut中浓度组 6 0.67±0.07#△ 0.62±0.07#△ 0.71±0.08#△ Lut高浓度组 6 0.80±0.11#△▲ 0.89±0.09#△▲ 0.90±0.10#△▲ 与对照组比较, *P < 0.05; 与BLM组比较, #P < 0.05; 与Lut低浓度组比较, △P < 0.05; 与Lut中浓度组比较, ▲P < 0.05。
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