Study on molecular evolutionary rules of drug resistance mutations in CRF01-AE subtype of HIV-1 strain by high-throughput sequencing
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摘要:目的 探讨CRF01-AE亚型人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）毒株在药物选择压力下耐药突变发生和演变的规律。方法 选取5例一线方案治疗失败的CRF01-AE亚型HIV-1患者，收集其6~8年抗病毒治疗过程中的系列血样，应用高通量测序方法进行基因型耐药突变分析。结果 ① 5例患者在启动治疗后早期即出现M184V突变以及非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）类耐药突变，常见的有K101E、G190A和K103N，其中M184V+G190A+TAMs是常见突变组合，停药或更换二线药物，这些突变也始终存在。②胸腺嘧啶脱氧核苷类似物变异（TAMs）突变形成过程中，有3例患者表现为TAM2路径，1例患者为TAM1途径，还有1例患者前期只有TAM2路径的突变，后期累加上TAM1途径的突变。③有3例患者在治疗过程中分别形成TAMs、Q151M复合体和T69插入复合物等多重耐药突变，更换二线方案后仍然治疗失败。结论 ① CRF01-AE亚型耐药患者在用药早期即开始出现耐药突变，数种突变逐渐累加，最终导致临床耐药，应尽早进行耐药突变监测。② TAMs突变通过2种途径竞争性发展，CRF01-AE亚型更偏向于TAM2途径，但随着治疗时间延长，2种途径可以产生融合。③更换二线方案前应排查针对替诺福韦（TDF）的耐药突变，其可能会导致二线方案无效。
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关键词:
- 人类免疫缺陷病毒1型 /
- 耐药突变 /
- 高通量测序 /
- 分子进化规律 /
- 非核苷类逆转录酶抑制剂
Abstract:Objective To investigate the occurrence and development rules of drug-resistant mutations in CRF01-AE subtype of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) strain under the pressure of drug selection.Methods Totally 5 HIV-1 CRF01-AE subtype patients with failure of first-line antiretroviral therapy were selected, and blood samples were longitudinally collected during the course of 6 to 8 years of treatment. Genotypic analysis of drug resistance mutations was performed by high throughput sequencing.Results ① All the patients had the M184V mutation and a certain type of non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) high-frequency major drug resistance mutations at early stage after medication, common sites were K101E, G190A and K103N, and combination of M184V plus G190A plus TAMs was the common mutations. Mutations was still existed after stopping the corresponding drugs or switching to second-line drugs. ② In the process of thymidine analogue mutations (TAMs) formation, 3 patients had TAM2 pathway, 1 patient had TAM1 pathway, and another patient had only TAM2 pathway mutations in the early stage and accumulated TAM1 pathway mutations in the later stage. ③ Three patients formed multi-drug resistance mutations including TAMs, Q151 complex and 69 insertion complexes, and they still failed in treatment after changing the second-line regimen.Conclusion ① CRF01-AE subtype drug resistance patients begin to develop drug resistance mutations at the early stage of drug use, and several mutations gradually lead to clinical drug resistance, so drug resistance mutation monitoring should be carried out as soon as possible. ② TAMs mutations are competitive in two pathways, CRF01-AE favors the TAM2 pathway. As the treatment time is prolonged, the two pathways can produce fusion. ③ It is recommended to carry out drug resistance testing before switching to the second-line protocol. If the resistance mutation against tenofovir (TDF) is found, the second-line regimen may be ineffective. -
参附注射液的主要成分有人参和附子提取物，作用机制主要包括增强心肌收缩力、扩张冠状动脉、改善微循环以及抗血栓形成等[1]。药理研究[2]发现，人参皂苷具有抗氧化、抗炎和抗血小板聚集等作用，附子中的生物碱具有镇痛、抗炎、扩张冠状动脉等功效[3]。因此，参附注射液可以通过多方面协同作用，在一定程度上改善急性心肌梗死(AMI)患者的心功能，减轻临床症状，提高生活质量[4]。细胞焦亡是指细胞在一系列内部及外部环境刺激下发生的一种被动性死亡过程。与凋亡相比，细胞焦亡通常是由外部环境急剧变化或者恶劣条件所致，如突发的缺血、缺氧等[5]。细胞焦亡与AMI存在紧密关联，在AMI中扮演着重要角色[6]。本研究探讨参附注射液辅助治疗对AMI大鼠NOD样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶1(Caspase-1) 介导的细胞焦亡信号通路以及炎性水平的影响机制，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 动物来源
随机选择7周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠40只(平均体质量为160 g), 购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号: SCXK(京)2020-0005。适宜环境正常饲养1周后进行实验。
1.2 实验分组及处理
40只大鼠随机分为假手术组、模型组、倍他乐克组和联合组，每组10只，除了假手术组，其他3组采用结扎左冠状动脉前降支的方法复制AMI模型。主要流程为: 腹腔注射1%戊巴比妥钠(2 mL/kg)进行麻醉处理，将大鼠置于实验台上并连接生物信息采集系统，顺利进行气管插管后连接小动物呼吸机，调整潮气量(10 mL/kg)和呼吸频率(呼吸比1∶ 1, 呼吸频率90次/min)。经胸骨左侧第3~4肋间手术入路，撑开肋骨暴露心脏，于左心耳下缘与心尖连线中点上方2~3 mm处用6-0缝合针结扎左冠状动脉前降支，观察可见心尖左前壁心肌发白，心电图肢体导联ST段弓背抬高持续0.5 h以上可判断为AMI造模成功[6]。假手术组只穿线不结扎。术后大鼠放置于40 ℃恒温电热毯上保温，苏醒后放回干净笼舍继续正常饲养。
造模后，倍他乐克组给予倍他乐克(阿利斯康制药有限公司，批号H32025391, 每片25 mg), 生理盐水配成质量浓度为0.9 mg/kg混悬液。联合组应用倍他乐克0.9 mg/kg联合参附注射液(雅安华润三九药业有限公司，国药准字Z20043116, 规格为每支100 mL)6 mL/kg, 假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃，连续处理3周。
1.3 检测方法
1.3.1 酶联免疫吸附测定(ELISA)
检测造模前、造模后和治疗3周后大鼠血清肌钙蛋白I(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB), 以及白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α), 采集鼠尾静脉血10 mL, 处理后根据ELISA试剂盒(购自江苏碧云天科技有限公司)说明书步骤进行检测。
1.3.2 心脏彩超
手术操作再灌注3 d后，各组大鼠予以心脏彩色超声检测，探头采用小动物S12超声探头，频率设定6~12 MHz, 探头切迹朝向大鼠头部，观察大鼠心脏运动稳定后，测定左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)等心脏参数。上述参数均由本院高年资的有经验的B超技师负责收集，每项指标均检测3次，最后取平均值为准。
1.3.3 四唑红(TTC)染色
TTC染色测量造模后(每组3只)和治疗3周后(每组7只)大鼠心肌梗死面积，沿正中线打开胸腔，取出心脏用生理盐水冲洗干净, -20 ℃冷冻15 min, 沿心脏垂直长轴横切制成厚约1 mm的切片，置于2% TTC染液中37 ℃恒温孵育24 h。应用Imagepro plus软件进行计算，心肌梗死范围=左心室梗死区面积/(左心室总面积-左心腔面积)×100%。
1.3.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)
qRT-PCR法检测心肌NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表达。TRIzol试剂提取总RNA, 微量分光光度计检测分子浓度，根据反转录试剂盒说明书合成cDNA, 以cDNA为模板进行PCR反应，引物由上海生工公司设计合成。引物序列: NLRP3 , 上游5′-CTCATGCCCTCCAGCCAG-3′, 下游5′-GGTCCAAGGCCAGCTCTG-3′; Caspase-1 , 上游5′-ATCGCGCTACAGT-3′, 下游5′-CGTGCACAGTGCGAT-3′; 内参GAPDH, 上游5′-CTGCGGAAAGTGCTCATCAGT-3′, 下游5′-TG GCAGAGCGAACAATAAGGC-3′。反应条件: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s, 共40个循环。反应体系: SYBR Green Master Premix 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、双蒸水7 μL。采用2-△△Ct法计算目的基因相对于内参GAPDH的表达量。
1.3.5 Western blot
各组大鼠心室肌组织剪碎匀浆后，加细胞裂解液充分裂解，再离心分离收集组织液的总蛋白。以GAPDH蛋白为内参，分别取待检标本总蛋白和GAPDH蛋白各30 μg。制备分离胶, 10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将上述混合液经过蛋白电泳分离后，转印到PVDF膜上，在37 ℃环境温度下用5%胎牛血清封闭2 h。加入抗大鼠NLRP3 (1∶ 5 000)、Caspase-1(1∶ 5 000)或GAPDH(1∶ 5 000)一抗稀释液，混匀后在4 ℃下静置过夜。弃去一抗，采用磷酸盐缓冲液(PBS)液洗涤3次，加1∶ 500兔抗大鼠IgG二抗，在室温下孵育2 h。再用PBS液洗涤3次。加入ECL试剂显影定影，以蛋白条带分析软件计算目标蛋白条带的相对浓度，计算NLRP3、Caspase-1蛋白各自与GAPDH蛋白条带的灰度比值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素ANOVA分析，两两比较采用LSD-t法检验，多个时间点数据比较采用整体重复测量的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组大鼠不同时点cTnI和CK-MB水平比较
所有大鼠均存活至实验结束。与假手术组相比，模型组造模后和治疗3周后大鼠血清cTnI和CK-MB水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01); 与模型组相比，联合组和倍他乐克组治疗3周后cTnI和CK-MB水平降低，且联合组cTnI和CK-MB水平低于倍他乐克组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表 1。
表 1 各组大鼠不同时点cTnI和CK-MB水平比较(x±s)组别 cTnI/(ng/mL) CK-MB/(U/L) 造模前 造模后 治疗3周后 造模前 造模后 治疗3周后 假手术组 0.05±0.01 0.06±0.01 0.07±0.01 3.03±0.15 5.04±0.26 5.23±0.16 模型组 0.06±0.01 3.56±0.24** 3.42±0.25** 2.83±0.05 56.53±8.87** 50.16±8.78** 倍他乐克组 0.04±0.01 3.59±0.26** 2.41±0.22**# 2.68±0.08 60.25±10.16** 31.19±6.46**# 联合组 0.06±0.01 3.62±0.35** 0.59±0.03**#△ 3.13±0.15 58.87±10.46** 10.16±3.16**#△ cTnI: 肌钙蛋白I; CK-MB: 肌酸激酶同工酶。
与假手术组比较, * * P＜0.01; 与模型组比较, #P＜0.05; 与倍他乐克组比较, △P＜0.05。2.2 各组大鼠不同时点炎症指标比较
与假手术组相比，模型组造模后和治疗3周后大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高，差异有统计学意义(P＜0.01); 与模型组相比，倍他乐克组和联合组治疗3周后IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低，且联合组上述指标水平低于倍他乐克组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表 2
表 2 各组大鼠不同时点IL-6、IL-1β和TNF-α水平比较(x±s)mg/L 组别 IL-6 IL-1β TNF-α 造模前 造模后 治疗3周后 造模前 造模后 治疗3周后 造模前 造模后 治疗3周后 假手术组 0.52±0.05 1.23±0.16 0.88±0.14 0.29±0.06 0.92±0.12 0.63±0.07 0.78±0.12 1.78±0.36 1.32±0.24 模型组 0.62±0.11 12.25±2.25** 9.80±2.09** 0.30±0.08 8.90±0.54** 8.13±0.45** 0.78±0.15 20.24±3.15** 16.76±2.77** 倍他乐克组 0.68±0.06 13.47±2.36** 6.50±1.16**# 0.40±0.05 9.20±0.66** 5.45±0.25**# 1.03±0.14 23.45±3.52** 10.16±1.57**# 联合组 0.59±0.05 14.52±2.55** 2.30±0.15**#△ 0.40±0.06 9.00±0.68** 1.25±0.06**#△ 0.88±0.16 25.45±4.16** 4.17±0.26**#△ IL-6: 白细胞介素-6; IL-1β: 白细胞介素-1β; TNF-α: 肿瘤坏死因子-α。与假手术组比较, * * P＜0.01;
与模型组比较, #P＜0.05; 与倍他乐克组比较, △P＜0.05。2.3 各组大鼠不同时点心室超声结构指标比较
与假手术组相比，模型组造模后和治疗3周后大鼠LVEF降低，LVEDD升高，差异有统计学意义(P＜0.01); 与模型组相比，倍他乐克组和联合组治疗3周后LVEF升高, LVEDD降低，且联合组LVEF高于倍他乐克组, LVEDD低于倍他乐克组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表 3。
表 3 各组大鼠不同时点心室超声结构指标比较(x±s)组别 LVEF/% LVEDD/mm 造模前 造模后 治疗3周后 造模前 造模后 治疗3周后 假手术组 76.41±3.01 77.12±3.13 76.86±3.25 5.24±0.31 5.29±0.25 5.21±0.26 模型组 77.30±2.87 51.02±2.56** 52.36±2.43** 5.30±0.26 6.05±0.19** 6.02±0.26** 倍他乐克组 78.03±2.92 55.18±2.72** 58.53±2.51**# 5.27±0.28 5.82±0.28** 5.71±0.28**# 联合组 75.82±2.83 60.41±2.23** 67.53±2.64**#△ 5.26±0.30 5.73±0.22** 5.46±0.35**#△ LVEF: 左心室射血分数; LVEDD: 左心室舒张末期内径。与假手术组比较, * * P＜0.01; 与模型组比较, #P＜0.05;
与倍他乐克组比较, △P＜0.05。2.4 各组大鼠不同时点心肌梗死面积比较
与假手术组相比，模型组造模后和治疗3周后心肌梗死面积增大，差异有统计学意义(P＜0.01); 与模型组相比，倍他乐克组和联合组治疗3周后心肌梗死面积减小，且联合组心肌梗死面积小于倍他乐克组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 1。
2.5 NLRP3、Caspase-1的mRNA及蛋白表达
与假手术组相比，模型组造模后和治疗3周后大鼠心肌NLRP3和Caspase-1的mRNA及其蛋白表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.01); 与模型组相比，倍他乐克组和联合组治疗3周后NLRP3和Caspase-1的mRNA及其蛋白表达量降低，且联合组低于倍他乐克组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图 2。
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图 2 各组大鼠心肌NLRP3和Caspase-1 mRNA及蛋白表达A: NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表达水平; B: NLRP3和Caspase-1蛋白表达。
与假手术组相比, **P＜0.01; 与模型组相比, #P＜0.05; 与倍他乐克组比较, △P＜0.05。3. 讨论
参附注射液作为一种中药制剂，具有活血化瘀、抗炎镇痛、扩张冠状动脉、减轻心肌损伤等作用。临床研究[7-8]表明，参附注射液能够有效改善心肌梗死患者心肌的缺血缺氧状态，减轻心绞痛症状，促进心肌坏死组织修复，从而对心肌梗死具有一定的治疗作用。在临床上，参附注射液作为辅助治疗手段应用于心肌梗死、心力衰竭等患者[9]。刘海燕等[10]研究表明，参附注射液能够保护心力衰竭大鼠的心脏功能，减轻氧化应激反应，抑制炎症因子表达，可能与激活P13K/Akt/mTOR信号通路有关。WANG X等[11]在中国大陆10个中心开展了一项多中心、随机、双盲、平行组、安慰剂对照试验RESTORE(NCT04493840), 共入选326例首次前壁ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者，在症状出现后12 h内接受初次经皮冠状动脉介入治疗(PPCI), 然后以1∶ 1方式随机分成再灌注前接受静脉注射参附注射液组(参附注射液80 mL联合5%葡萄糖注射液70 mL)和安慰剂组(5%葡萄糖注射液150 mL), 每天1次，直到PPCI后5 d。主要终点是PPCI后(5±2) d心脏磁共振成像评估梗死面积，次要终点包括微血管阻塞、心肌内出血、左心室容积和射血分数，以及30 d内的主要心血管不良事件，结果证实参附注射液对接受PPCI的STEMI患者心肌损伤有较好的临床疗效。参附注射液常见的不良反应包括低血压、恶心、呕吐、注射部位疼痛等，需要密切监测患者的生命体征和不良反应，及时调整用药剂量，做好护理工作，减少不良反应的发生。
细胞焦亡在心肌梗死中同样扮演重要的角色。在心肌梗死的发展过程中，细胞焦亡导致心肌细胞大量死亡，进一步加重心肌损伤程度，加速心肌坏死区域扩展，导致心功能急剧下降，还可能诱发严重的心律失常及心力衰竭[12-13]。因此，阻止或减少细胞焦亡在心肌梗死中的进程，对于挽救患者的心功能和改善预后具重要的临床意义。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡形式，涉及细胞内部的炎症和信号通路，这个过程机制包括细胞内蛋白质聚集、线粒体功能损伤以及细胞膜的通透性改变，导致促炎因子的释放和促进炎症反应的启动，其对机体的免疫调节和应对外界伤害具有重要的意义[14-15]。NLRP3是一种重要的免疫调节功能蛋白，在细胞内信号传导和炎症反应中发挥重要的作用。NLRP3通路的活化可以引发炎症小体的形成，促进促炎因子IL-1β和IL-18的成熟和释放[16-17]。Caspase-1是一种关键的促炎酶，主要参与机体炎症反应的调节以及细胞凋亡的执行。活化后的Caspase-1能够介导IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和释放，加剧炎症反应[18-19]。此外, Caspase-1还能在一定条件下介导细胞凋亡过程，促进受损细胞的死亡[20-21]。因此, Caspase-1在炎症和细胞凋亡中发挥着关键的作用。细胞焦亡与NLRP3/Caspase-1信号通路存在着密切的联系。一方面，细胞焦亡的发生可以活化NLRP3通路，引起炎症小体的形成和促炎因子的释放[22-23]; 另一方面, NLRP3通路的异常激活也可能加剧细胞焦亡的进程[24-25]。这种相互促进的关系使得细胞焦亡和NLRP3/Caspase-1信号通路在多种疾病的发生发展过程中产生协同作用，影响炎症反应和细胞存活[26-27]。
本研究结果显示，模型组造模后和治疗3周后大鼠血清cTnI、CK-MB、IL-6、IL-1β和TNF-α水平、心肌梗死面积、心肌NLRP3和Caspase-1的mRNA及其蛋白表达量较假手术组显著升高(P＜0.05), 提示炎症反应和心肌NLRP3/Caspase-1介导的细胞焦亡参与了AMI的发生及演变过程; 倍他乐克组和联合组治疗3周后cTnI、CK-MB、IL-6、IL-1β和TNF-α、心肌梗死面积、 NLRP3和Caspase-1的mRNA及其蛋白表达量较模型组显著降低，且联合组显著低于倍他乐克组(P＜0.05), 提示参附注射液辅助西药治疗AMI能够进一步降低心肌损伤和心肌梗死面积，抑制炎症反应和细胞焦亡活性，较单纯西药效果更明显。
综上所述，参附注射液辅助治疗AMI能够进一步降低心肌细胞损伤和梗死面积，抑制炎症反应和细胞焦亡活性。
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表 1 一步法RT-PCR引物信息
方向 引物名称 引物序列 位置 正向 MAW-26 TGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 2 027~2 050 反向 RT-21 CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG 3 509~3 539 
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表 2 模板特异性引物序列信息
名称 序列 位置 扩增长度 Pro-F 5′-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3′ 2 147~2 166 459 bp Pro-R 5′-GGGCCATCCATTCCTGGC-3′ 2 588~2 605 RTA-F 5′-AGCCCTATTGAGACTGTACCAG-3′ 2 556~2 577 488 bp RTA-R 5′-GTCATGCTACTTTGGAATATTG-3′ 3 022~3 043 RTB-F 5′-ACCATACCTAGTATAAACAATGAG-3′ 2 940~2 963 522 bp RTB-R 5′-TGCCAGTTCTAGCTCTGCTTCTTC-3′ 3 438~3 461
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表 3 标本的基本信息
患者 标本序号 治疗方案 采样时间 CD4/(个/mm3) RNA/(copies/mL) 第1例 1 D4T+3TC+NVP 2005-09-15 108 35 442 2 D4T+3TC+NVP 2006-02-14 96 56 323 3 D4T+3TC+NVP 2007-07-10 150 10 520 4 AZT+IDV+DDI 2009-01-08 5 21 000 5 AZT+IDV+DDI 2009-10-10 165 2 532 6 AZT+IDV+DDI 2010-04-07 160 9 606 7 克力芝+3TC+TDF 2011-08-03 130 45 345 8 克力芝+3TC+TDF 2012-07-03 18 373 000 9 克力芝+3TC+TDF 2013-03-26 240 15 480 第2例 1 AZT+3TC+NVP 2007-09-25 162 24 556 2 AZT+3TC+NVP 2007-12-10 153 24 366 3 AZT+3TC+NVP 2008-12-10 93 100 200 4 AZT+3TC+NVP 2009-06-10 47 89 598 5 AZT+DDI+IDV 2010-03-03 206 6 584 6 TDF+克力芝+3TC 2011-09-08 309 2 546 7 TDF+克力芝+3TC 2012-04-10 156 609 000 8 TDF+克力芝+3TC 2013-01-09 53 1 300 000 第3例 1 D4T+3TC+EFV 2006-09-08 184 34 566 2 D4T+3TC+EFV 2007-04-10 142 66 542 3 D4T+3TC+EFV 2008-10-20 173 52 344 4 D4T+3TC+EFV 2009-10-20 228 34 649 5 D4T+3TC+EFV 2010-07-14 20 26 951 6 D4T+3TC 2011-04-13 69 10 718 7 TDF+3TC+克力芝 2012-08-07 28 154 000 8 TDF+3TC+克力芝 2013-02-05 6 3 201 000 第4例 1 D4T+3TC+NVP 2005-08-17 183 34 554 2 D4T+3TC+NVP 2006-03-20 365 22 454 3 D4T+3TC+NVP 2007-12-10 476 12 446 4 D4T+3TC+NVP 2008-12-10 576 10 200 5 D4T+3TC+NVP 2009-06-10 546 6 369 6 D4T+3TC+NVP 2010-03-03 516 7 991 7 TDF+3TC+克力芝 2011-11-03 268 0 8 TDF+3TC+克力芝 2012-02-08 275 0 第5例 1 D4T+3TC+NVP 2007-07-25 186 13 220 2 D4T+3TC+NVP 2007-09-20 315 6 556 3 D4T+3TC+NVP 2008-12-18 231 8 955 4 D4T+3TC+NVP 2009-09-24 216 12 542 5 D4T+3TC+NVP 2010-09-16 160 10 669 6 D4T+3TC+NVP 2011-06-23 218 87 552 7 克力芝+3TC+TDF 2012-04-25 185 0 8 克力芝+3TC+TDF 2013-04-23 318 0 D4T: 司他夫定; 3TC: 拉米夫定; EFV: 依非韦伦; TDF: 替诺福韦; NVP: 奈韦拉平; AZT: 齐多夫定; IDV: 茚地那韦; DDI: 去羟肌苷。
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表 4 第1例患者的主要耐药突变频率情况[n(%)]
标本序号 M184V D67N K219Q A62V Q151M G190A K238T M46I I84V 1 — — — — — — — — — 2 6 302(98.79) 559(100.00) — — — 6 262(99.20) — — — 3 7 871(98.85) 7 781(98.59) — — — 7 818(98.88) 2 401(29.12) — — 4 5 873(99.55) 1 305(99.77) 4 953(99.41) 1 804(99.72) — 5 860(99.91) 3 874(99.94) — — 5 6 602(99.45) 4 876(99.91) 1 160(32.63) 2 051(99.46) 3 485(100.00) 6 592(99.93) 4 886(99.91) 2 517(99.96) 1 454(61.66) 6 1 340(99.25) 2 041(99.46) 860(90.52) 2 091(99.66) 6 235(100.00) 1 340(99.25) 850(100.00) 2 583(99.84) 944(99.89) 7 8 168(99.62) 8 612(99.89) 4 379(82.08) 6 119(99.55) 2 013(100.00) 2 850(100.00) 4 897(100.00) 3 042(99.70) 1 300(92.85) 8 8 682(99.71) 3 065(100.00) 2 152(43.59) 370(100.00) 3 041(100.00) 8 602(99.89) 6 109(99.55) 2 542(99.96) 300(100.00) 9 858(98.51) 2 041(100.00) — 276(99.63) 4 412(100.00) 2 037(99.85) 2 295(99.31) 2 295(99.73) 874(100.00)
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表 5 第2例患者的主要耐药突变频率情况[n(%)]
标本序号 M184V D67N M41L L210W T215F G190A K101E V82A M46I 1 — — — — — — — — — 2 — — — — — 5 237(98.24) 6 430(99.92) — — 3 8 013(99.91) 240(8.72) 3 715(95.97) 3 990(82.26) 3 990(82.26) 7 937(99.84) 3 145(99.80) — — 4 9 882(99.78) 4 866(99.91) 3 352(97.57) 5 559(93.58) 5 559(93.58) 9 798(99.83) 3 382(97.57) — — 5 7 540(99.88) 2 954(99.89) 2 954(99.89) 2 642(99.92) 2 642(99.92) 7 483(99.97) 3 103(98.82) 57(2.73) — 6 6 512(99.87) 7 751(98.59) 4 056(99.93) 620(91.17) 620(91.17) 6 470(99.92) 2 776(98.44) 1 613(99.81) 2 467(100.00) 7 5 703(99.87) 6 119(99.73) 6 119(99.73) 436(100.00) 436(100.00) 5 563(99.61) 5 247(98.29) 1 566(99.87) 2 227(100.00) 8 8 144(99.82) 8 622(99.89) 7 837(99.84) 1 121(98.59) 1 121(98.59) 8 072(99.98) 6 592(99.93) 1 780(97.80) 1 465(100.00)
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表 6 第3例患者的主要耐药突变频率情况[n(%)]
标本序号 耐药突变频率%(突变序列数/总序列数) M184V D67N K70R K219Q T69N/D K103N G190A M46I I47V 1 — — — — — — — — — 2 7 840(99.84) 511(100.00) 511(100.00) — 88(15.82) — 6 173(80.69) — — 3 7 657(99.85) 6 140(90.65) 6 140(90.65) 5 222(85.10) 213(3.12) 6 102(99.28) 7 498(99.97) — 41(1.72) 4 10 151(99.91) 6 513(98.54) 5 443(99.54) 7 155(96.07) 6 273(80.69) 3 743(98.88) 9 965(99.97) — — 5 7 576(99.86) 5 433(99.54) 5 433(99.54) 5 533(99.80) 5 433(99.54) 5 305(99.71) 7 474(99.77) — — 6 4 886(99.91) 4 256(98.42) 4 091(99.66) 5 873(99.55) 9 633(99.85) 5 453(99.54) 5 414(99.95) — — 7 9 681(99.84) 3 461(96.97) 2 923(99.55) 6 413(98.54) 2 923(99.55) 3 502(94.67) 9 501(99.93) 2 628(100.00) 2 743(98.88) 8 8 082(99.80) 2 587(97.03) 2 587(97.03) 5 296(99.04) 4 246(98.42) 1 745(50.96) 7 953(99.93) 2 190(99.86) 2 337(99.10)
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