Application of matrix-assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry system in identification of pathogenic bacteria
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摘要:目的 探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）在快速鉴定血流感染病原菌的应用价值，并分析MALDI-TOF MS方法鉴定病原菌的准确性。方法 收集321例血流感染患者的血液标本进行血培养，微生物室细菌培养结果均为阳性。从血培养阳性瓶中取病原菌至分离胶促凝管中，应用MALDI-TOF MS对富集的病原菌进行菌种鉴定。同时，对血培养瓶中的阳性标本进行常规培养，获得的纯菌落采用VITEK 2 COMPACT微生物分析系统进行检测，并将MALDI-TOF MS检测结果与VITEK 2 COMPACT结果进行对比。若检测结果有差异，则进一步进行基因测序法予以确定。结果 321例阳性血培养标本中共分离出180株革兰阴性杆菌，MALDI-TOF MS鉴定准确率为97.78%，无鉴定错误，但4株无鉴定结果；分离出的141株革兰阳性菌中，主要以革兰阳性球菌为主，MALDI-TOF MS鉴定准确率为84.39%，1株蜡样芽胞杆菌误鉴定为大肠埃希菌，出现了菌属水平鉴定错误，其余为种类鉴定错误。结论 与传统血培养及生化鉴定比较，MALDI-TOF MS在血流感染中的鉴定符合率较高，且鉴定方法简便、迅速。
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关键词:
- 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 /
- 病原菌 /
- 血流感染 /
- 血培养
Abstract:Objective To explore the value of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) in the rapid identification of pathogenic bacteria in bloodstream infections, and to analyze the accuracy of MALDI-TOF MS method.Methods Blood samples from 321 patients with bloodstream infection were collected for blood culture, and the results of bacterial culture in microbiology laboratory were all positive. Pathogenic bacteria was taken from the positive blood culture flask and placed into a separate gel tube, and MALDI-TOF MS was used to identify the enriched bacteria; at the same time, the samples were routinely cultured, and the pure colonies obtained were detected by VITEK 2 COMPACT microbial analysis system, and the identification results of the two methods were compared. If there were differences in the test results, further gene sequencing method would be carried out to determine.Results Among 321 specimens for blood culture, 180 strains of Gram-negative bacilli were isolated, the identification accuracy rate of MALDI-TOF MS was 97.78%, no identification errors occurred and 4 strains were not identified. Among 141 strains of Gram-positive bacteria isolated, the Gram-positive coccus accounted for the most, and the identification accuracy rate of MALDI-TOF MS was 84.39%. One strain of Bacillus cereus was mistakenly identified as Escherichia coli, and there was an error in the identification of the genus level; the remaining was identified incorrectly at the level of the species.Conclusion Compared with traditional blood culture and biochemical identification methods, MALDI-TOF MS method has a higher accordance rate in bloodstream infection, and the method is simple and rapid. -
中国是全球30个结核病高负担国家之一，尽管近年来结核病发病的绝对数和发病率均缓慢下降，但耐药问题日益严重[1]。《耐药结核病化学治疗指南(2019年简版)》[2]提出，在耐多药结核病化学治疗方案中，临床应优先选择高代氟喹诺酮类药品。目前认为氟喹诺酮类药物耐药机制主要为耐药基因决定区(QRDR)gyrA基因或gyrB基因的突变，其中QRDR的gyrA基因突变是最主要机制，可解释60%~90%的耐药表型[3-4]，故分析不同gyrA基因突变类型的菌株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(MIC)可为结核病的药物治疗提供参考依据。本研究以结核分枝杆菌临床分离株作为研究样本，检测其gyrA基因耐药决定区突变情况，并分析其与氟喹诺酮类药物MIC的关系，旨在为结核病的临床治疗提供指导。
1. 材料与方法
1.1 菌株
收集江苏省徐州市传染病医院2017年10月—2019年10月分离的640株痰结核分枝杆菌阳性临床分离株作为研究标本，结核分枝杆菌标准株(H37Rv)来自江苏省疾控中心结核病实验室保存株(ATCC27294号)。
1.2 试剂
结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测试剂盒(福建厦门致善生物有限公司，国械注准20163401457)，左氧氟沙星(BA7020)、氧氟沙星(BA7014)、加替沙星(BA7026-1)、莫西沙星(BA7022)药敏试剂盒均购自珠海贝索生物公司, Alamar blue显色液(美国伯乐生命医学有限公司, BUF012B)。
1.3 菌株基因组DNA模板制备
采用煮沸法提取菌株基因组DNA。采用标准接种环收集细菌2~3环，转移至含250 μL DNA提取液的无菌Eppendorf离心管中，反复吹打重悬细菌; 菌液100 ℃ 20 min煮沸灭活，以12 000 g离心10 min, 取上清液于-20 ℃保存备用。
1.4 聚合酶链反应(PCR)-探针熔解分析法
① 体系: 2×FQ PCR Mix(含扩增引物、FAM标记的耐药突变位点检测探针、4×dNTP、PCR缓冲液、ddH2O)19.6 μL, 0.4 μL TB酶混合液(UNG酶及taq DNA聚合酶)，样本DNA 5 μL。②条件: UNG酶处理，50 ℃ 2 min, 变性90 ℃ 10 min; 95 ℃ 10 s, 65 ℃ 20 s(每个循环下降1 ℃), 78 ℃ 25 s, 10个循环; 95 ℃ 10 s，61 ℃ 15 s(检测荧光), 78 ℃ 15 s, 循环45次，荧光通道选用FAM和HEX; 熔解分析程序: 95 ℃ 2 min, 40 ℃ 2 min, 40~85 ℃(每1 ℃采集FAM和HEX通道荧光信号)，循环1次。③结果分析: 通过比较样品及阳性对照熔解曲线Tm值差异确定样品是否发生突变，与阳性对照熔点一致判定为野生型，低于阳性对照2 ℃以上判定为突变型。
1.5 PCR扩增及测序
对PCR-探针熔解分析法检测到的对氟喹诺酮类药物耐药的菌株进行gyrA基因扩增及测序，基因扩增引物序列为[5]上游引物5′-TGACATCGAGCAGGAGATGC-3′、下游引物5′-GGGCTTCGGTGTACCTCATC-3′, 测序由上海康黎医学检验所完成，采用BLAST网站将测序结果与标准菌株基因序列进行比较。
1.6 药物MIC测定
采用微孔板稀释法对筛选出的gyrA基因突变菌株进行结核分枝杆菌菌株MIC的检测。①梯度浓度药物微孔板的制备: 设置氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、加替沙星药物的浓度梯度为0.001 5、0.003、0.006、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000 μg/mL。② MIC检测: 菌株已提前培养2~3周，将液体培养基以4 000 g离心15 min, 取沉淀，采用无菌盐水稀释至1个麦氏浓度，按1∶100稀释后向微孔板加入100 μL菌液，将微孔板置于37 ℃下孵育，培养48 h后查看有无污染，确定无异常后孵育至7 d, 在对照孔中细菌生长良好的前提下读取抑制结核菌可见生长的最小浓度，若样本孔内浓度小于临界浓度，则判定为敏感，大于相应的值则判为耐药，抑制结核分枝杆菌生长的最低药物浓度为最低MIC。耐药标准[5-8]: 氧氟沙星或左氧氟沙星的耐药临界点浓度为 < 2.0 μg/mL, 低水平耐药为4.0~ < 8.0 μg/mL, 高水平耐药为≥8.0 μg/mL; 莫西沙星耐药临界点浓度为 < 0.5 μg/mL, 低水平耐药为1.0~ < 2.0 μg/mL, 高水平耐药为≥2.0 μg/mL; 加替沙星耐药临界点浓度为 < 1.0 μg/mL, 低水平耐药为2.0~ < 4.0 μg/mL, 高水平耐药为≥4.0 μg/mL。
1.7 统计学分析
采用SPSS 19.0统计学软件分析数据，不同突变类型菌株耐药率、MIC的比较采用卡方检验或Fisher精确检验，检验水准α=0.05, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 结核分枝杆菌菌株gyrA基因突变情况分析
640株痰菌阳性临床分离株中共检测到gyrA基因突变株45株(7.03%), 其中94位点突变26株(57.78%)、90位点突变15例(33.33%)、91位点突变4株(8.89%)。90位点氨基酸变化为丙氨酸(Ala)→缬氨酸(Val), 91位点氨基酸变化为丝氨酸(Ser)→脯氨酸(Pro), 94位点氨基酸变化为天冬氨酸(Asp)→酪氨酸(Tyr)、Asp→天冬酰胺(Asn)、Asp→Ala、Asp→甘氨酸(Gly)。见表 1。
表 1 结核分枝杆菌分离株gyrA基因突变情况分析位点 突变类型 氨基酸变化 菌株数/株 占比/% 90 gCg→gTg Ala→Val 15 33.33 91 Tcg→Ccg Ser→Pro 4 8.89 94 Gac→Tac Asp→Tyr 4 8.89 Gac→Aac Asp→Asn 6 13.33 gAc→gCc Asp→Ala 6 13.33 gAc→gGc Asp→Gly 10 22.22 Ala: 丙氨酸; Val: 缬氨酸; Ser: 丝氨酸; Pro: 脯氨酸; Asp: 天冬氨酸; Tyr: 酪氨酸; Asn: 天冬酰胺; Gly: 甘氨酸。 2.2 不同类型gyrA基因突变菌株的氧氟沙星耐药情况
90位点突变菌株和94位点突变为Tyr、Asn、Gly的菌株检出氧氟沙星高水平耐药。见表 2。
表 2 不同类型gyrA基因突变菌株的氧氟沙星耐药情况[n(%)]突变类型 菌株数/株 表型DST 氧氟沙星MIC/(μg/mL) 低水平耐药菌株 高水平耐药菌株 1.000 2.000 4.000 8.000 16.000 32.000 90Ala→Val 15 0 2(13.33) 4(26.67) 9(60.00) 0 2(13.33) 0 0 91Ser→Pro 4 0 0 0 4(100.00) 0 0 0 0 94Asp→Tyr 4 0 1(25.00) 0 3(75.00) 0 1(25.00) 0 0 94Asp→Asn 6 2(33.33) 2(33.33) 0 2(33.33) 2(33.33) 2(33.33) 0 0 94Asp→Ala 6 0 0 0 6(100.00) 0 0 0 0 94Asp→Gly 10 2(20.00) 4(40.00) 1(10.00) 3(30.00) 2(20.00) 2(20.00) 2(20.00) 0 Ala: 丙氨酸; Val: 缬氨酸; Ser: 丝氨酸; Pro: 脯氨酸; Asp: 天冬氨酸; Tyr: 酪氨酸; Asn: 天冬酰胺; Gly: 甘氨酸; MIC: 最低抑菌浓度。 2.3 不同类型gyrA基因突变菌株的左氧氟沙星耐药情况
各位点突变菌株均未检出左氧氟沙星高水平耐药, 94位点突变为Tyr、Asn、Gly的菌株检出左氧氟沙星低水平耐药。见表 3。
表 3 不同类型gyrA基因突变菌株的左氧氟沙星耐药情况[n(%)]突变类型 菌株数/株 表型DST 左氧氟沙星MIC/(μg/mL) 低水平耐药菌株 高水平耐药菌株 0.250 0.500 1.000 2.000 4.000 8.000 16.000 90Ala→Val 15 0 0 0 8(53.33) 5(33.33) 2(13.33) 0 0 0 91Ser→Pro 4 0 0 0 0 4(100.00) 0 0 0 0 94Asp→Tyr 4 2(50.00) 0 0 0 0 2(50.00) 2(50.00) 0 0 94Asp→Asn 6 3(50.00) 0 0 0 2(33.33) 1(16.67) 3(50.00) 0 0 94Asp→Ala 6 0 0 0 0 2(33.33) 4(66.67) 0 0 0 94Asp→Gly 10 2(20.00) 0 0 0 4(40.00) 4(50.00) 2(20.00) 0 0 Ala: 丙氨酸; Val: 缬氨酸; Ser: 丝氨酸; Pro: 脯氨酸; Asp: 天冬氨酸; Tyr: 酪氨酸; Asn: 天冬酰胺; Gly: 甘氨酸; MIC: 最低抑菌浓度。 2.4 不同类型gyrA基因突变菌株的莫西沙星耐药情况
90位点、91位点突变菌株和94位点突变为Tyr、Asn、Gly、Ala的菌株均检出莫西沙星高水平耐药菌株，其中91位点突变菌株和94位点突变为Tyr、Asn、Gly的菌株高水平耐药检出率≥50%。见表 4。
表 4 不同类型gyrA基因突变菌株的莫西沙星耐药情况[n(%)]突变类型 菌株数/株 表型DST 莫西沙星MIC/(μg/mL) 低水平耐药菌株 高水平耐药菌株 0.250 0.500 1.000 2.000 4.000 8.000 16.000 90Ala→Val 15 3(20.00) 2(13.33) 6(40.00) 4(26.67) 3(20.00) 0 2(13.33) 0 0 91Ser→Pro 4 0 2(50.00) 0 2(50.00) 0 0 2(50.00) 0 0 94Asp→Tyr 4 0 2(50.00) 0 2(50.00) 0 0 2(50.00) 0 0 94Asp→Asn 6 0 4(66.67) 0 2(33.33) 0 0 4(66.66) 0 0 94Asp→Ala 6 2(33.33) 2(33.33) 0 2(33.33) 2(33.33) 0 2(33.33) 0 0 94Asp→Gly 10 0 5(50.00) 0 5(50.00) 0 0 2(20.00) 3(30.00) 0 Ala: 丙氨酸; Val: 缬氨酸; Ser: 丝氨酸; Pro: 脯氨酸; Asp: 天冬氨酸; Tyr: 酪氨酸; Asn: 天冬酰胺; Gly: 甘氨酸; MIC: 最低抑菌浓度。 2.5 不同类型gyrA基因突变菌株的加替沙星耐药情况
90位点、91位点突变菌株和94位点突变为Tyr、Asn、Gly、Ala的菌株检出加替沙星高水平耐药菌株，其中91位点突变为Tyr、Asn、Gly的菌株高水平耐药检出率≥50%。见表 5。
表 5 不同类型gyrA基因突变菌株的加替沙星耐药情况[n(%)]突变类型 菌株数/株 表型DST 加替沙星MIC/(μg/mL) 低水平耐药菌株 高水平耐药菌株 0.125 0.250 0.500 1.000 2.000 4.000 8.000 16.000 90Ala→Val 15 0 3(20.00) 7(46.67) 1(6.67) 3(20.00) 1(6.67) 0 3(20.00) 0 0 91Ser→Pro 4 0 1(25.00) 1(25.00) 1(25.00) 0 1(25.00) 0 1(25.00) 0 0 94Asp→Tyr 4 1(25.00) 2(50.00) 0 1(25.00) 0 0 1(25.00) 2(50.00) 0 0 94Asp→Asn 6 0 4(66.67) 1(16.67) 1(16.67) 0 0 0 4(66.67) 0 0 94Asp→Ala 6 1(16.67) 2(33.33) 0 2(33.33) 0 1(16.67) 1(16.67) 2(33.33) 0 0 94Asp→Gly 10 1(10.00) 6(60.00) 2(20.00) 0 0 1(10.00) 1(10.00) 4(40.00) 2(20.00) 0 Ala: 丙氨酸; Val: 缬氨酸; Ser: 丝氨酸; Pro: 脯氨酸; Asp: 天冬氨酸; Tyr: 酪氨酸; Asn: 天冬酰胺; Gly: 甘氨酸; MIC: 最低抑菌浓度。 3. 讨论
WANG Z等[9]报道, 202株临床分离株中, 15株(7.4%)出现氧氟沙星耐药，其中有12株发生gyrA基因突变。本研究从徐州地区640例痰菌阳性临床分离株中检测到45株(7.03%)gyrA基因突变菌株，其中90位点突变15株、91位点突变4株、94位点突变26株，与相关研究[10-11]报道结果相似。
本研究结果显示, 45株gyrA基因突变株对氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星的低水平耐药与高水平耐药比例分别为4∶9、7∶0、5∶17和3∶18。由此可见, 4种药物中，氧氟沙星、莫西沙星和加替沙星主要表现为高水平耐药，而左氧氟沙星仅表现为低水平耐药。CHERNYAEVA E[12]等报道, 32例gyrA突变及氧氟沙星耐药菌株中，低水平耐药与高水平耐药的比例为12∶20, 与本研究结果相似。本研究还发现, 90、91和94位点突变菌株对左氧氟沙星均为低水平耐药，与相关研究[13]报道的94Asp→Asn/Tyr、94Asp→Gly、94Asp→His突变菌株为高水平耐药的结果不同，这可能与该研究检测出的耐药菌株数量偏少和地区差异有关。CHIEN J Y等[7]报道, 15株94Asp→Gly突变菌株中有12株为高水平耐药，这与本研究结论一致。
相关研究[14]表明，氟喹诺酮类药物耐药基因gyrA基因突变主要发生在结核分枝杆菌的QRDR, 多数位于基因保守区67~106位点，本研究显示gyrA基因突变主要发生于90位点、91位点和94位点，其中94位点突变最多，与其他报道结果类似。不同耐药基因位点的突变与结核分枝杆菌耐药水平存在一定差异[15-16], 90位点及94位点氨基酸突变可引起结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物的高水平耐药[17]。本研究发现，以94位点突变为例, 94位点Asp突变为Asn、Gly、Tyr的菌株更易对除左氧氟沙星以外的3种药物表现出高水平耐药，提示这些氨基酸突变是引起结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物高水平耐药的因素。相关研究[18]报道, 94位点Asp突变为Gly、半胱氨酸、Asn等可引起高水平耐药，而突变为Ala、Tyr可引起低水平耐药。分析原因，可能是氨基酸性质的改变影响了耐药性, Gly、Asn均为非电离极性氨基酸，而Ala、Tyr等氨基酸为非极性，与原94位点氨基酸Asp性质相似，故对耐药性的影响较小，耐药浓度变化不明显[19]。
本研究以痰菌阳性临床分离株为研究对象，研究范围更广，适用于普通痰菌阳性患者，具有广泛的应用价值。本研究应用探针熔解曲线法对结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物gyrA基因耐药决定区突变进行检测初步筛选耐药株，与传统药敏试验和基因测序相比，具有简便、快速、准确的优点，有利于早期判断患者是否耐药。对探针熔解曲线法检测的耐药株进行基因测序检测不同耐药位点，不必对每一个痰菌阳性株都进行测序，提高了效率，节约了成本，也为研究结核分枝杆菌gyrA基因突变类型与氟喹诺酮类药物耐药的关系提供了一种科学、简便的研究方法。采用MicroDSTTM微孔板方法测定MIC，与传统比例法相比具有快速、准确、简便的优势。分析研究结果后，结合患者临床，对于低水平耐药患者可通过适当加大药物剂量来提高治疗效果。尽管目前已有较多研究证实gyrA基因突变为结核分枝杆菌氟喹诺酮类药物耐药的主要机制，但仍有部分耐药株未能检测到突变，这可能与gyrB基因突变有关，或因为部分突变发生在QRDR以外区域。因此，临床对gyrB基因耐药决定区及其他区域耐药机制的探索仍需进一步深入[20-21]。
综上所述，结核分枝杆菌gyrA基因突变与氟喹诺酮类药物耐药水平及MIC密切相关，其中以94位点基因突变最多。检测菌株的基因突变类型可预测患者对氟喹诺酮类药物的耐药水平，从而为结核病患者治疗方案的选择提供依据。但本研究存在一定局限性，如样本数量较少，且仅涉及gyrA基因突变，未对其他耐药机制及耐药基因进行分析，未来仍需扩大样本量并拓展研究范围深入探讨，从而为结核病的临床用药提供重要参考。
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表 1 321株临床分离株MALDI-TOF MS鉴定结果[n(%)]
菌属 菌名 VITEK2 COMPAC方法 MALDI-TOF MS方法 鉴定株数/株 鉴定准确 鉴定错误/株 未鉴定出 革兰阴性菌(n=180) 大肠埃希菌 30 29(96.67) 0 1(3.33) 肺炎克雷伯菌 30 29(96.67) 0 1(3.33) 铜绿假单胞菌 20 20(100.00) 0 0 鲍曼不动杆菌 20 20(100.00) 0 0 阴沟肠杆菌 20 19(95.00) 0 1(5.00) 黏质沙雷菌 20 20(100.00) 0 0 产气肠杆菌 20 20(100.00) 0 0 嗜麦芽窄食单菌 20 19(95.00) 0 1(5.00) 革兰阳性菌(n=141) 金黄色葡萄球菌 30 27(90.00) 1(3.33) 3(10.00) 表皮葡萄球菌 30 25(83.33) 1(3.33) 4(13.33) 屎肠球菌 20 17(85.00) 1(5.00) 2(10.00) 粪肠球菌 20 16(80.00) 2(10.00) 2(10.00) 肺炎链球菌 20 19(95.00) 0 1(5.00) 溶血葡萄球菌 20 15(75.00) 1(5.00) 4(20.00) 蜡样芽孢杆菌 1 0 1(100.00) 0 
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