Relationships between expressions of Yes associated protein as well as carbonic anhydrase IX protein and occurrence as well as development of nasopharyngeal carcinoma
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摘要:目的 探讨鼻咽癌组织中Yes相关蛋白（YAP）、碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达与肿瘤发生发展的关系。方法 选取鼻咽癌组织标本80例为鼻咽癌组，鼻咽黏膜慢性炎症组织80例为对照组，采用免疫组化染色检测2组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达情况，并分析不同年龄、性别及病理学特征的鼻咽癌组织中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达差异。结果 鼻咽癌组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率分别为76.25%、58.75%，高于对照组的36.25%、20.00%，差异有统计学意义（P < 0.05）。在未分化及病理学分期Ⅲ、Ⅳ期的鼻咽癌组织中，YAP蛋白阳性表达率高于分化型及病理学分期Ⅰ、Ⅱ期的鼻咽癌组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。在不同年龄、性别、病灶最大径、是否发生淋巴结转移、病理学分化程度、病理学分期的鼻咽癌组织中，碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 鼻咽癌组织中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达显著上调，其中YAP蛋白表达与肿瘤的发生发展关系密切。Abstract:Objective To investigate the relationship between the expression of Yes associated protein (YAP), carbonic anhydrase Ⅸ protein and occurrence, development of nasopharyngeal carcinoma.Methods Totally 80 tissue specimens of nasopharyngeal carcinoma were selected as nasopharyngeal carcinoma group, and 80 chronic inflammation tissues of nasopharyngeal mucosa were selected as control group. The expression of YAP protein and carbonic anhydrase IX protein in both groups were detected by immunohistochemistry, and the differences of YAP protein and carbonic anhydrase Ⅸ protein expression in nasopharyngeal carcinoma tissues with different age, gender and pathological characteristics were analyzed.Results The positive expression rates of YAP protein and carbonic anhydrase Ⅸ protein in the nasopharyngeal carcinoma group were 76.25% and 58.75% respectively, which were significantly higher than 36.25% and 20.00% in the control group (P < 0.05).The positive expression rates of YAP protein in the non-differentiated and pathological phase Ⅲ to Ⅳ nasopharyngeal carcinoma tissues were significantly higher than those in the differentiated and pathological phase Ⅰ to Ⅱ nasopharyngeal carcinoma tissues (P < 0.05). There were no significant differences in the positive expression rate of carbonic anhydrase Ⅸ protein in nasopharyngeal carcinoma tissues of patients with different ages, gender, maximum diameter of focus, condition of lymph node metastasis, pathological differentiation and pathological phase (P>0.05).Conclusion The expressions of YAP protein and carbonic anhydrase Ⅸ protein in nasopharyngeal carcinoma tissues are significantly up-regulated, and YAP protein expression is closely related to the occurrence and development of tumor.
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鼻咽癌是一种低分化肿瘤，起源于鼻咽黏膜，具有高度侵袭性和易转移的特点，鼻咽的位置隐蔽，不易被检查发现，早期临床症状也不明显，容易延误诊断和治疗[1]。鼻咽癌的主要临床症状有头痛、出血和颈部淋巴结肿大。相较于T1~2期鼻咽癌患者, T4期患者的5年局部控制率较差，患者预后不良[2]。Yes相关蛋白(YAP)基因位于11q22, 并在人体内几乎所有组织中均有表达[3]，特别是在胎盘组织、前列腺组织、睾丸组织、卵巢组织中表达水平较高，但在外周血白细胞中检测不到[4]。碳酸酐酶Ⅸ是一种跨膜蛋白，是与肿瘤相关的蛋白，主要在正常的上消化道和胰腺、胆囊、肝脏等相关器官中表达，在许多实体瘤中也高度表达[5]。本研究分析鼻咽癌组织中YAP、碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达与肿瘤发生、发展的关系，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2016年2月—2019年4月本院经病理学检查证实的鼻咽癌组织标本80例(鼻咽癌组)、鼻咽黏膜慢性炎症组织标本80例(对照组)。纳入标准: ①鼻咽癌的诊断标准参考《外科学(第8版)》[6]中的相关标准; ②所有患者均经病理学检查证实; ③在获取本研究相关标本前，患者均未接受放化疗; ④患者年龄、性别及病理学检测结果完整。排除标准: ①伴有其他部位恶性肿瘤者; ②合并免疫系统疾病患者; ③长期使用免疫调节剂、糖皮质激素者; ④合并造血系统疾病者; ⑤合并其他类型的鼻咽部疾病者。
鼻咽癌组年龄44~77岁，平均(63.70±8.00)岁; 男52例，女28例; 病理学分化程度包括分化型29例，未分化型51例; 鼻咽癌病理学分期包括Ⅰ期12例, Ⅱ期23例, Ⅲ期37例, Ⅳ期8例; 淋巴结转移45例; 病灶最大径>2.0 cm者45例, ≤2.0 cm者35例。对照组年龄38~75岁，平均(62.50±11.30)岁。2组患者年龄、性别对比，差异无统计学意义(P>0.05)。
1.2 方法
应用抗生物素蛋白免疫组织检测法。主要步骤: 石蜡切片4.0 mm, 60 ℃烘烤3 h, 常规脱蜡，加3%过氧化氢(H2O2)处理10 min; 在室温下孵育, PBS洗涤3次, 3 min/次; 柠檬酸溶液修复, PBS洗涤3次, 3 min/次; 加一抗孵育过夜, PBS洗涤3次, 3 min/次; 添加聚合物增强剂，在室温下孵育20 min, PBS洗涤3次, 3 min/次，添加酶标记的抗小鼠聚合物(二抗)，在室温下孵育30 min, PBS洗涤3次, 3 min/次，用水冲洗，用苏木精染色，封片。试剂盒购自北京中山生物制品有限公司。
1.3 评价标准
YAP蛋白阳性染色表达于细胞质或细胞核，碳酸酐酶Ⅸ蛋白的阳性染色表达于细胞核, YAP蛋白与碳酸酐酶Ⅸ蛋白的阳性染色呈黄色、棕黄色、褐色表达，依据染色的程度计分，未染色计0分，淡黄色染色计1分，棕黄色染色计2分，褐色、黑色染色计3分。根据染色的细胞比率计分，染色细胞比率≤10%计1分, >10%~50%计2分, >50%~75%计3分, >75%计4分。染色程度与阳性细胞的计分乘积 < 3分为阴性, ≥3分为阳性。
1.4 统计学处理
采用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理，年龄等计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用t检验; YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白等计数资料的组间比较采用χ2检验; P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较
免疫组化染色后，鼻咽癌组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率分别为76.25%、58.75%, 对照组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率分别为36.25%、20.00%, 差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 1、图 1。
表 1 2组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较[n(%)]组别 n YAP蛋白 碳酸酐酶Ⅸ蛋白 阳性 阴性 阳性 阴性 鼻咽癌组 80 61(76.25)* 19(23.75)* 47(58.75)* 33(41.25)* 对照组 80 29(36.25) 51(63.75) 16(20.00) 64(80.00) 与对照组比较, *P < 0.05。 ![]()
图 1 2组YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白免疫组化染色后的光镜表现(放大倍数40倍)A: 对照组YAP蛋白表现; B: 鼻咽癌组YAP蛋白表现; C: 对照组碳酸酐酶Ⅸ蛋白表现; D: 鼻咽癌组碳酸酐酶Ⅸ蛋白表现。2.2 鼻咽癌组不同临床病理学特征下YAP蛋白阳性表达率比较
在不同年龄、性别、病灶最大径、是否发生淋巴结转移的鼻咽癌组织中, YAP蛋白阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05); 在未分化及病理学分期Ⅲ、Ⅳ期的鼻咽癌组织中, YAP蛋白阳性表达率高于分化型及病理学分期Ⅰ、Ⅱ期的鼻咽癌组织，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 2。
表 2 鼻咽癌组不同临床病理学特征下YAP蛋白阳性表达率比较[n(%)]因素 n YAP阳性 YAP阴性 χ2 P 年龄 ≥60岁 42 34(80.95) 8(19.05) 1.080 0.299 < 60岁 38 27(71.05) 11(28.95) 性别 男 52 38(73.08) 14(26.92) 0.826 0.363 女 28 23(82.14) 5(17.86) 分化程度 未分化 51 43(84.31) 8(15.69) 5.052 0.025 分化型 29 18(62.07) 11(37.93) 病理学分期 Ⅰ、Ⅱ期 35 21(60.00) 14(40.00) 9.073 0.003 Ⅲ、Ⅳ期 45 40(88.89) 5(11.11) 病灶最大径 >2.0 cm 45 37(82.22) 8(17.78) 2.026 0.155 ≤2.0 cm 35 24(68.57) 11(31.43) 淋巴结转移 是 45 38(84.44) 7(15.56) 3.814 0.051 否 35 23(65.71) 12(34.29) 2.3 鼻咽癌组不同临床病理学特征下碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较
在不同年龄、性别、病灶最大径、是否发生淋巴结转移、病理学分化程度、病理学分期的鼻咽癌组织中，碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表 3。
表 3 鼻咽癌组不同临床病理学特征下碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较[n(%)]因素 n 碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性 碳酸酐酶Ⅸ蛋白阴性 χ2 P 年龄 ≥60岁 42 28(66.67) 14(33.33) 2.287 0.130 < 60岁 38 19(50.00) 19(50.00) 性别 男 52 33(63.46) 19(36.54) 1.361 0.243 女 28 14(50.00) 14(50.00) 分化程度 未分化 51 32(62.75) 19(37.25) 0.927 0.336 分化型 29 15(51.72) 14(48.28) 病理学分期 Ⅰ、Ⅱ期 35 24(68.57) 11(31.43) 2.477 0.116 Ⅲ、Ⅳ期 45 23(51.11) 22(48.89) 病灶最大径 >2.0 cm 45 29(64.44) 16(35.56) 1.376 0.242 ≤2.0 cm 35 18(51.43) 17(48.57) 淋巴结转移 是 45 30(66.67) 15(33.33) 2.660 0.103 否 35 17(48.57) 18(51.43) 3. 讨论
鼻咽癌在中国的发病率较高，发病年龄为30~50岁[7], 发病隐匿，诊断时约75%的患者处于中晚期，5年生存率低于50%[8]。鼻咽癌的发生是一个多阶段、多路径、多机制的过程，发病机制较为复杂，与遗传和环境因素有关[9]。治疗后复发和远处转移是影响患者预后的主要因素，但其发生机制尚不清楚[10]。因此，研究鼻咽癌的发生、发展的分子机制，对鼻咽癌患者的诊断、治疗和预后评估具有重要的意义。
YAP分子量约65 kD, 富含脯氨酸，是Hippo信号通路中的主要效应子，其过表达与肿瘤发生有关[11]。Hippo通路在遗传上高度保守，其主要功能是调节细胞生长、增殖和凋亡之间的平衡，并参与调节胚胎的生长发育和细胞接触性抑制，该途径发生异常时可引发多种疾病[12]。Hippo-YAP信号通路一旦发生异常，细胞增殖与凋亡间的平衡将被破坏，导致肿瘤形成[13]。本研究结果显示，鼻咽癌组织中的YAP蛋白阳性表达率显著高于对照组，推测YAP在鼻咽癌的发生、发展中起重要的作用，是鼻咽癌靶向治疗新的分子标记和靶标，可能是因哺乳动物不育系中20样激酶的表达降低或缺失所致，但具体机制仍不清楚。在未分化及Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌组织中, YAP蛋白阳性表达率高于分化型及Ⅰ、Ⅱ期鼻咽癌组织，与患者年龄、性别、病灶最大径、是否发生淋巴结转移等无关，这可能与组织器官特异性有关。
碳酸酐酶是与缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)调控系统内缺氧相关的靶基因[14]。研究[15]证实实体瘤中缺氧微环境的存在是影响肿瘤生物学行为以及放疗和化疗效果的重要因素。碳酸酐酶Ⅸ蛋白是一种由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，主要表达于细胞膜基底的外侧，促使肿瘤细胞“内碱外酸”，利于肿瘤细胞耐缺氧[16]。碳酸酐酶Ⅸ蛋白的表达强度与癌细胞的分化、侵袭深度和复发频率有关，表达水平越高提示预后越差[17]。研究[18]表明，碳酸酐酶Ⅸ蛋白活性抑制剂可用于治疗缺氧性肿瘤，表明碳酸酐酶Ⅸ蛋白参与了肿瘤的形成。本研究结果显示，鼻咽癌组织中的碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率显著高于对照组，但其表达水平与肿瘤的临床病理特征无显著相关性，可能是快速生长的肿瘤细胞促进了氧化磷酸化和无氧酵解，从而改变了肿瘤的微环境。碳酸酐酶Ⅸ蛋白参与了与肿瘤转化有关的葡萄糖代谢的转移，并促使肿瘤细胞中的碱变成外源酸，从而为肿瘤的生长、转移和侵袭创造了条件。
综上所述，鼻咽癌组织中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白表达显著上调，其中YAP蛋白表达与肿瘤的发生、发展关系密切，但YAP、碳酸酐酶Ⅸ蛋白的分子调节机制尚不明确，仍需进一步的研究。
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图 1 2组YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白免疫组化染色后的光镜表现(放大倍数40倍)
A: 对照组YAP蛋白表现; B: 鼻咽癌组YAP蛋白表现; C: 对照组碳酸酐酶Ⅸ蛋白表现; D: 鼻咽癌组碳酸酐酶Ⅸ蛋白表现。
表 1 2组标本中YAP蛋白、碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较[n(%)]
组别 n YAP蛋白 碳酸酐酶Ⅸ蛋白 阳性 阴性 阳性 阴性 鼻咽癌组 80 61(76.25)* 19(23.75)* 47(58.75)* 33(41.25)* 对照组 80 29(36.25) 51(63.75) 16(20.00) 64(80.00) 与对照组比较, *P < 0.05。 
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表 2 鼻咽癌组不同临床病理学特征下YAP蛋白阳性表达率比较[n(%)]
因素 n YAP阳性 YAP阴性 χ2 P 年龄 ≥60岁 42 34(80.95) 8(19.05) 1.080 0.299 < 60岁 38 27(71.05) 11(28.95) 性别 男 52 38(73.08) 14(26.92) 0.826 0.363 女 28 23(82.14) 5(17.86) 分化程度 未分化 51 43(84.31) 8(15.69) 5.052 0.025 分化型 29 18(62.07) 11(37.93) 病理学分期 Ⅰ、Ⅱ期 35 21(60.00) 14(40.00) 9.073 0.003 Ⅲ、Ⅳ期 45 40(88.89) 5(11.11) 病灶最大径 >2.0 cm 45 37(82.22) 8(17.78) 2.026 0.155 ≤2.0 cm 35 24(68.57) 11(31.43) 淋巴结转移 是 45 38(84.44) 7(15.56) 3.814 0.051 否 35 23(65.71) 12(34.29)
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表 3 鼻咽癌组不同临床病理学特征下碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性表达率比较[n(%)]
因素 n 碳酸酐酶Ⅸ蛋白阳性 碳酸酐酶Ⅸ蛋白阴性 χ2 P 年龄 ≥60岁 42 28(66.67) 14(33.33) 2.287 0.130 < 60岁 38 19(50.00) 19(50.00) 性别 男 52 33(63.46) 19(36.54) 1.361 0.243 女 28 14(50.00) 14(50.00) 分化程度 未分化 51 32(62.75) 19(37.25) 0.927 0.336 分化型 29 15(51.72) 14(48.28) 病理学分期 Ⅰ、Ⅱ期 35 24(68.57) 11(31.43) 2.477 0.116 Ⅲ、Ⅳ期 45 23(51.11) 22(48.89) 病灶最大径 >2.0 cm 45 29(64.44) 16(35.56) 1.376 0.242 ≤2.0 cm 35 18(51.43) 17(48.57) 淋巴结转移 是 45 30(66.67) 15(33.33) 2.660 0.103 否 35 17(48.57) 18(51.43)
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期刊类型引用(1)
1. 彭爱琴，费正东，张阿娥，汤德. MR CE-T1WI的影像组学对鼻咽癌复发的预测. 宁夏医科大学学报. 2023(10): 1015-1020 . 
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