Effects of expression of activator protein-1 and polytumour activator in tissue of non-small cell lung cancer on prognosis
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摘要:目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中活化蛋白-1（AP-1）、多瘤促活化因子（PEA3）表达情况对患者预后的影响。方法 收集75例NSCLC患者肺癌组织及距癌组织>5 cm处癌旁组织石蜡标本，采用免疫组化法（SP）检测肺癌组织及癌旁组织中AP-1、PEA3蛋白表达水平，分析其表达与NSCLC患者临床病理参数的关系，采用Kaplan-Meier法分析AP-1、PEA3表达与NSCLC患者预后的关系，并对NSCLC患者不良预后的危险因素进行Cox回归分析。结果 肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05）。肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达与患者吸烟史、分化程度、TNM分期、淋巴结转移及胸膜转移有关（P < 0.05）。肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达患者5年总生存率均低于阴性表达患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。TNM分期高、胸膜转移、肺癌组织AP-1蛋白阳性表达、PEA3蛋白阳性表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素（P < 0.05）。结论 肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达会影响NSCLC患者的预后，对NSCLC预后评估可能具有临床指导意义。Abstract:Objective To study the effects of activator protein-1 (AP-1) and polytumor activator factor (PEA3) levels in tissue of non-small cell lung cancer (NSCLC) on prognosis of patients.Methods Lung cancer tissues and adjacent tissues more than 5 cm away from cancer tissues of 75 patients with NSCLC were collected. The expression levels of AP-1 and PEA3 in NSCLC lung cancer and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry (SP), the relationships between their expressions and clinicopathological parameters of NSCLC patients were analyzed, Kaplan-Meier was used to analyze the relationships between AP-1, PEA3 expression and the prognosis of NSCLC patients, COX was used to analyze the risk factors affecting the poor prognosis of NSCLC patients.Results The positive rates of AP-1 and PEA3 proteins in lung cancer tissues were significantly higher than those of adjacent tissues(P < 0.05). The positive expressions of AP-1 and PEA3 proteins in lung cancer tissues were related to smoking history, differentiation degree, TNM stage, lymph node metastasis and pleural metastasis of NSCLC patients (P < 0.05). The 5-year overall survival rate of patients with positive expressions of AP-1 and PEA3 proteins in lung cancer tissues was significantly lower than those with negative expressions (P < 0.05). The high TNM stage, pleural metastasis, positive expressions of AP-1 and PEA3 proteins in lung cancer tissues were risk factors affecting the poor prognosis of NSCLC patients (P < 0.05).Conclusion The positive expression of AP-1 and PEA3 protein in lung cancer tissues affects the prognosis of NSCLC patients, and may have some clinical significance for the prognosis evaluation of NSCLC.
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Keywords:
- non-small cell lung cancer /
- activator protein-1 /
- polytumour activator /
- prognosis
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肾细胞癌(RCC)是一种常见肿瘤，占所有癌症的3%。近20年来，世界范围内的肾癌发病率每年大致递增2%[1]。肾透明细胞癌(ccRCC)是一种常见的RCC，较乳头状细胞癌和嫌色细胞癌有更高的复发率、转移率及死亡率[2]。既往研究[3]显示肾透明细胞癌TNM分期1~4期的5年癌症特异性生存率分别为91%、74%、67%和32%。尽管肾脏相关手术可在一定程度上延长RCC患者的生存时间，但术后长期治疗效果并不理想，死亡率和复发率相对较高[4]。欧洲泌尿外科协会(EAU)指南[5-7]指出，术后预测系统、诺模图(Nomogram)可能较常规的TNM分期、Fuhrman分级对预后的预测更加准确。既往有一些RCC预后相关的Nomogram研究，但多数只纳入传统的临床信息，如肿瘤分期、分级等变量，并且仅关注模型的准确性，较少关注临床获益，从而无法全面评估模型的临床应用价值。本研究通过全面分析大样本ccRCC患者术后相关的临床资料，构建临床用于预测患者预后的预测模型，并使用决策曲线分析(DCA)等方法评估模型的预测价值，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 诊断标准
收集2013年1月—2017年12月本院行肾根治或肾部分切手术患者，术后病理为ccRCC。选取病理分期为T1N0M0、T2N0M0的患者。排除标准: 非ccRCC患者; 既往临床资料不全者; 合并其他类型肿瘤者; 多发RCC者; 死于其他原因、术后接受过其他治疗者。
1.2 资料收集
收集的资料包括患者的年龄、性别、体质量指数(BMI)、吸烟史、高血压史、糖尿病(DM)史、临床症状、全身症状、高脂血症、家族肿瘤史、D-二聚体、血清白蛋白、血清钙离子、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、贫血、术前肌酐、肿瘤大小、肿瘤分期和肿瘤病理分级。吸烟史定义为患者连续或累积的吸烟时间超过6个月[8]; 临床症状指肉眼血尿、腰痛和腹部肿块; 全身症状指体质量减轻和发热; 肿瘤分期参考国际抗癌联盟TNM分期标准; 肿瘤分级根据1982年Fuhrman分类标准; 肿瘤直径通过CT测量，分为≤4 cm、>4~ < 7 cm、≥7 cm; 无病生存期(DFS)定义为术后至首次肿瘤复发转移、肿瘤原因导致死亡或随访结束的时间。所有患者术后2年内每3个月进行1次血常规、血生化检查及胸腹部CT检查，第3年开始每6个月复查1次，第5年后每年复查1次。
1.3 统计学方法
应用SPSS 25.0(IBM, Armonk, NY, USA)、STATA 15.0(Stata Corp., College Station, TX, USA)和R语言(version 3.0.1; http://www.Rproject.org)软件进行数据的统计分析处理，连续性变量的正态性由Kolmogorov-Smirnov检验确定。正态分布的连续变量采用(x±)表示，非正态连续变量采用中位数(四分位数间距)表示。通过单因素及多因素Cox比例风险回归模型分析预后的相关危险因素，并用于构建Nomogram。P < 0.05为差异有统计学意义。一致性指数(CI)用于评价模型的预测能力, 0.5为没有预测能力, 1.0为完美预测。吻合线(calibration plots)用于校准模型。完美标准为倾斜角为45 °的直线。DCA计算此模型在不同风险阈值下的临床净获益[9]。
2. 结果
本研究共纳入526例患者，平均随访时间44个月; 年龄 < 50岁151例(28.7%), 50~ < 60岁179例(34.0%), 60~ < 70岁177例(33.7%), ≥70岁19例(3.6%); 男335例(63.7%), 女191例(36.3%), 体质量指数为(22.2±1.4) kg/m2; 有吸烟史53例(10.1%), 有临床症状129例(24.5%), 有副瘤综合征57例(10.8%), 有高血压109例(20.7%), 有糖尿病47例(8.9%), 有高脂血症22例(4.2%), 有家族肿瘤史11例(2.1%), 有贫血140例(26.6%); D-二聚体正常477例(90.7%), 异常49例(9.3%); 白蛋白 < 40 g/L者119例(22.6%), ≥40 g/L者407例(77.4%); 血清钙离子为2.3 mmol/L(2.2, 2.4), 白细胞为7.8×109/L(6.2, 9.4), 中性粒细胞为4.1×109/L(3.1, 5.3), 淋巴细胞为1.8×109/L(1.5, 2.2), 血小板为228.0×109/L(190.5, 272.5), 术前肌酐为66.3 μmol/L(55.2, 76.8); 肿瘤病理分级Ⅰ~Ⅱ级460例(87.5%), Ⅲ~Ⅳ级66例(12.5%); T分期为T1期393例(74.7%), T2期133例(25.3%); 肿瘤大小 < 4 cm者281例(53.4%), 4~ < 7 cm者91例(17.3%), ≥7 cm者154例(29.3%)。
526例患者中, 43例出现终点事件(7.6%)。单因素分析显示年龄、临床症状、高血压病史、高脂血症、D-二聚体、白蛋白、贫血、术前肌酐、病理分级、肿瘤大小与预后相关(P < 0.05)。多因素Cox比例风险回归用于构建预测模型，最终模型包括年龄、临床症状、贫血、D-二聚体、肿瘤大小。见表 1、图 1。
表 1 预后相关危险因素的多因素分析变量 HR 95% CI P 年龄 1.428 1.059~1.925 0.020 贫血 1.782 0.949~3.346 0.072 D-二聚体 3.650 1.877~7.099 < 0.001 肿瘤大小 1.613 1.107~2.350 0.013 临床症状 1.909 0.999~3.648 0.005 HR: 风险比; CI: 置信区间。 ![]()
图 1 预后相关因素的Nomogram模型年龄: 1表示 < 50岁, 2表示50~ < 60岁, 3表示60~ < 70岁, 4表示≥70岁; 临床症状: 0表示无, 1表示有; 贫血: 0表示无, 1表示有; D-二聚体: 0表示阴性, 1表示阳性; 肿瘤大小: 1表示 < 4 cm,
2表示4~ < 7 cm, 3表示≥7 cm。CI用于评价模型预测能力。本模型的CI为0.78, 有较好的预测能力。本预测模型的校准曲线在理想模型下表现良好(图 2A、B)。术后36、60个月的DCA见图 2C、D。术后36个月时，此模型风险阈值为0.01~0.50时，净获益率大于0; 术后60个月时，风险阈值为0.01~0.58时，净获益率大于0，有临床意义。
3. 讨论
局限性ccRCC患者术后可能需要更长的随访时间，因此完善局限性ccRCC患者术后的预后评估，并针对性地建立完善的随访制度很有必要。目前ccRCC术后患者的预后判断仍主要基于TNM分期[10]。Nomogram作为一种可视化的、具有临床应用价值的医学预测模型，可以提供更加准确且个性化的预后评估。Nomogram可以客观评估新的预测变量。本研究选取的终点事件是DFS, 即首次出现ccRCC相关的预后问题，这比传统的总生存时间(OS)更能准确地反映患者术后的恢复情况。
本预测模型经过良好的校准和临床获益评估后，最终Nomogram纳入5项预测因子: 年龄、临床症状、贫血、D-二聚体和肿瘤大小。本研究认为临床症状与ccRCC患者预后有关，此结论在既往研究[6-7, 11]中存在争议，这可能是因为病情较轻的患者往往无明显的临床症状。既往研究[7, 11]表明贫血、肿瘤大小、年龄与ccRCC患者预后有关，与本研究结果一致。本研究中D-二聚体与ccRCC预后相关。既往研究[12]认为血液高凝状态与肾癌预后有关。D-二聚体作为常见的纤维蛋白原降解产物，可用于评估纤溶系统活性。ERDEM S等[13]研究表明，D-二聚体水平升高预示肾癌患者预后更差。
FRANK I等[7]认为钙离子与预后相关。钙离子作为胞内信号分子，参与调控细胞的增殖和凋亡，同时在肿瘤细胞中也有类似作用[14]。本研究中，并未发现钙离子与细胞增殖、凋亡的关联，这可能是2个研究的观察结局有差异所致。本研究的单因素分析中，白蛋白是预后相关危险因素。白蛋白可参与调节癌细胞系的增殖[15], 同时低蛋白血症与人体防御机制减弱相关[16]。既往研究[17-18]表明，血清白蛋白和RCC患者的预后有明显关联，且白蛋白水平越低，患者预后越差。全身炎症反应与肿瘤预后的关系已有相关探讨[19], 许多恶性肿瘤的发生、进展与感染、慢性炎症反应有关[20]。HU H等[21]研究发现，术前中性粒细胞和淋巴细胞比值可作为RCC术后患者预后的潜在预测因子。本研究中纳入的炎症相关细胞并未发现与预后相关，这可能与选取患者的纳入排除标准不同有关。本研究中发现贫血和白蛋白水平是与预后相关的危险因素，而这2项指标也被认为与慢性炎症相关[20]。
既往有研究建立Nomogram来评估RCC患者预后，其中KARAKIEWICZ P I等[11]的Nomogram较为经典且广为引用。KARAKIEWICZ P I等的研究用于评估RCC患者术后的肿瘤特异性生存，其研究纳入2 474例患者，经单因素和多因素Cox回归分析后，最终的Nomogram包括了肿瘤分期、Fuhrman分级、肿瘤大小和临床症状，预测准确性为89%。但该研究纳入变量较少，只分析传统的肿瘤学特征，并未纳入其他可能与预后有关的变量。YAYCIOGLU O等[22]研究非转移性RCC患者的无复发生存情况，发现年龄、性别、存在放射性淋巴结、临床症状、肿瘤大小和临床分期是预后相关预测因子，其最终构建的Nomogram的CI为0.747, 其模型的预测能力与本研究模型接近。
本研究全面分析大量ccRCC术后患者相关的临床资料，构建临床相关的用于预测患者预后的Nomogram, 并使用DCA等方法评估模型的预测和临床应用价值。本研究的局限性: ①本研究为单中心的回顾性研究; ②某些指标并无公认的分类截点，可能会产生误差。因此，后续仍需要采用具有统一标准的多中心、大样本的前瞻性队列研究来进一步验证和完善本模型。
综上所述，本研究通过分析患者人口学资料、实验室检查、肿瘤学资料，构建了准确度较高且有临床获益的Nomogram, 用于评估患者的无病生存情况，可为ccRCC患者术后随访及疾病干预提供参考。
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图 1 NSCLC患者癌组织及癌旁组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况(放大倍数400倍)
A: 癌旁组织中AP-1蛋白阴性表达图; B: 肺癌组织中AP-1蛋白阳性表达图; C: 癌旁组织中PEA3蛋白阴性表达图; D: 肺癌组织中PEA3蛋白阳性表达图。
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图 2 肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC患者5年生存率的关系
A: AP-1蛋白表达情况与总生存率的关系图; B: PEA3蛋白表达情况与总生存率的关系图。
表 1 NSCLC患者癌组织及癌旁组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况比较[n(%)]
组织 n AP-1蛋白 PEA3蛋白 阳性 阴性 阳性 阴性 癌旁组织 75 22(29.33) 53(70.67) 19(25.33) 56(74.67) 肺癌组织 75 44(58.67)* 31(41.33)* 42(56.00)* 33(44.00)* AP-1: 活化蛋白-1; PEA3: 多瘤促活化因子。与癌旁组织比较, *P < 0.05。 
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表 2 肺癌组织AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC临床病理参数及一般资料的关系[n(%)]
指标 n AP-1蛋白 PEA3蛋白 阴性表达(n=31) 阳性表达(n=44) χ2 P 阴性表达(n=33) 阳性表达(n=42) χ2 P 年龄 ≤60岁 36 14(45.16) 22(50.00) 0.032 0.858 15(45.45) 21(50.00) 0.025 0.874 >60岁 39 17(54.84) 22(50.00) 18(54.55) 21(50.00) 性别 男 43 18(58.06) 25(56.82) 0.017 0.897 19(57.58) 24(57.14) 0.039 0.843 女 32 13(41.94) 19(43.18) 14(42.42) 18(42.86) 吸烟史 无 38 25(80.65) 13(29.55) 17.009 <0.001 24(72.73) 14(33.33) 9.952 0.002 有 37 6(19.35) 31(70.45) 9(27.27) 28(66.67) 肿瘤直径 <3 cm 26 12(38.71) 14(31.82) 0.138 0.711 13(39.39) 13(30.95) 0.268 0.604 ≥3 cm 49 19(61.29) 30(68.18) 20(60.61) 29(69.05) 组织学分型 鳞癌 41 18(58.06) 23(52.27) 0.068 0.794 19(57.58) 22(52.38) 0.046 0.830 腺癌 34 13(41.94) 21(47.73) 14(42.42) 20(47.62) 分化程度 高分化 32 22(70.97) 10(22.73) 15.386 <0.001 21(63.64) 11(26.19) 9.117 0.003 中、低分化 43 9(29.03) 34(77.27) 12(36.36) 31(73.81) TNM分期 Ⅰ~Ⅱ期 35 22(70.97) 13(29.55) 10.929 0.001 23(69.70) 12(28.57) 10.960 0.001 Ⅲ~Ⅳ期 40 9(29.03) 31(70.45) 10(30.30) 30(71.43) 淋巴结转移 无 26 17(54.84) 9(20.45) 17.993 0.001 16(48.48) 10(23.81) 17.349 0.002 N0 11 7(22.58) 4(9.09) 8(24.24) 3(7.14) N1 13 4(12.90) 9(20.45) 6(18.18) 7(16.67) N2 16 2(6.45) 14(31.82) 2(6.06) 14(33.33) N3 9 1(3.23) 8(18.18) 1(3.03) 8(19.05) 胸膜转移 无 47 26(83.87) 21(47.73) 8.669 0.003 28(84.85) 19(45.24) 10.758 0.001 有 28 5(16.13) 23(52.27) 5(15.15) 23(54.76)
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表 3 NSCLC患者不良预后危险因素的Cox回归分析
变量 单因素分析 多因素分析 HR 95%置信区间 P HR 95%置信区间 P 年龄 1.483 0.812~2.708 0.167 0.994 0.763~1.295 0.286 性别 1.389 0.751~2.569 0.315 1.109 0.897~1.371 0.304 吸烟史 2.019 1.565~2.605 0.023 1.898 0.916~3.933 0.132 分化程度 3.207 1.856~5.541 < 0.001 1.437 0.824~2.506 0.082 TNM分期 3.520 1.811~6.842 < 0.001 3.123 1.425~6.845 < 0.001 淋巴结转移 2.784 1.211~6.400 < 0.001 1.524 0.913~2.544 0.074 胸膜转移 2.184 1.329~3.589 0.004 1.820 1.326~2.498 0.013 AP-1蛋白表达 2.863 1.452~5.645 0.001 2.314 1.482~3.613 0.010 PEA3蛋白表达 3.394 1.345~8.564 < 0.001 2.557 1.615~4.048 < 0.001
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