The mechanism of ghrelin in treating mice with bronchial asthma and its effect on pyroptosis
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摘要:目的 探讨胃饥饿素对小鼠支气管哮喘的治疗作用及对细胞焦亡的影响。方法 将30只小鼠随机分为对照组、模型组[卵清蛋白(OVA)造模]和治疗组(OVA联合胃饥饿素)，每组10只。构建小鼠哮喘模型，应用病理学和乙酰甲胆碱的反应性评估气道损伤情况。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素-13(IL-13)水平。应用免疫组化及病理学评估胃饥饿素对小鼠哮喘的治疗作用。通过Western blot分析肺组织中细胞焦亡相关蛋白的表达水平。结果 形态学结果显示，治疗组巨噬细胞浸润和炎性评分显著改善(P < 0.05)。Masson染色及气道反应性检测发现治疗组小鼠肺纤维化显著改善，呼吸系统阻力显著降低(P < 0.05)。与模型组相比，治疗组白细胞总数显著降低(P < 0.05)。治疗组治疗后TNF-α、IFN-γ、IL-5及IL-13表达水平显著低于模型组(P < 0.05)。肺组织中NLRP3表达量显著降低，NLRP3、Caspase-1及白细胞介素-1B (IL-1B)表达水平显著降低(P < 0.05)。结论 胃饥饿素可通过减轻细胞焦亡程度治疗哮喘，其可能为治疗哮喘提供新的思路。Abstract:Objective To investigate the therapeutic effect of ghrelin in mice with bronchial asthma and its effect on pyroptosis.Methods Thirty mice were randomly divided into control group, model group[ovalbumin (OVA) modeling] and treatment group (OVA combined with ghrelin), with 10 cases in each group. Mouse model of asthma was established, and airway injury was assessed by pathology and acetylcholine reactivity. The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleukin-5 (IL-5) and interleukin-13 (IL-13) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Immunohistochemistry and pathology were used to evaluate the therapeutic effect of ghrelin on asthma in mice. The expression levels of pyroptosis related proteins in lung tissues were analyzed by Western blot.Results Morphological results showed that the macrophage infiltration and inflammatory scores were significantly improved in the treatment group (P < 0.05). Masson staining and airway reactivity test showed that pulmonary fibrosis was significantly improved and respiratory resistance was significantly decreased in the treatment group (P < 0.05). Compared with model group, the total white blood cell count in treatment group was significantly decreased (P < 0.05). After treatment, the expression levels of TNF-α, IFN-γ, IL-5 and IL-13 in treatment group were significantly lower than those in model group (P < 0.05). NLRP3 expression in lung tissue was significantly decreased, and the expression levels of NLRP3, caspase-1 and interleukin-1B (IL-1B) were significantly decreased in the treatment group (P < 0.05).Conclusion Ghrelin can treat asthma by reducing the degree of pyroptosis, which may provide a new idea for the treatment of asthma.
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Keywords:
- ghrelin /
- asthma /
- inflammatory response /
- pyroptosis /
- pulmonary fibrosis
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呼吸道感染是儿童尤其是学龄前儿童(< 7岁)最常见的疾病之一，包括上呼吸道和下呼吸道感染，其中反复下呼吸道感染如肺炎是5岁以下儿童死亡的主要感染性疾病[1]。据流行病学调查[2]数据显示，中国学龄前儿童社区获得性肺炎的发病率约为0.22人次/年，尽管抗生素的应用大大降低了中国学龄前儿童社区获得性肺炎的病死率，但总体病死率仍维持在0.05%~1.50%。因此，积极探寻导致学龄前儿童反复呼吸道感染的潜在主要危险因素，指导临床早期干预是改善患儿生存预后的重要途径，具有十分重要的临床和社会意义。研究[3]认为，外界环境改变和机体防御系统减弱易导致反复呼吸道感染。流行病学危险因素如父母吸烟、儿童哮喘史被认为与反复呼吸道感染密切相关，但尚未达成共识[4]。由于反复呼吸道感染的发病机制复杂，任何单一因素不能对反复呼吸道感染起主导作用。目前，中国尚缺乏关于学龄前儿童反复呼吸道感染的大样本流行病学调查数据。本研究分析学龄前儿童反复呼吸道感染的主要危险因素，并建立定量列线图预测模型指导临床干预，先报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
采用横断面调查、分层整群随机抽样方法选择2018年10月—2020年10月3所幼儿园2 208例学龄前儿童作为研究对象。该研究遵循赫尔辛基宣言，获得父母知情同意权，经本院伦理委员会批准。幼儿园儿童年龄3~7岁，排除先天性疾病、气道畸形、慢性呼吸道疾病及中途转学患儿。采用结构式电子问卷对患者进行调查，由幼儿园教师填写完成，遵循儿童实际情况，填写者经培训完全熟悉各项调查内容，保证问卷回收率100%。调查问卷由专家组多次论证，经小样本抽样证实信度和效度均大于90%。
1.2 研究方法
根据反复呼吸道感染、上呼吸道感染和下呼吸道感染定义，对患儿情况进行诊断。采用单因素和多因素Logistic回归分析筛选主要危险因素，并建立列线图预测模型，采用受试者工作特征(ROC)曲线分析列线图的诊断效能。
调查数据包括儿童性别、年龄、城市/农村、体质量指数(BMI)、出生体质量、母乳喂养时间、哮喘史、过敏史、睡觉时是否打鼾、初次使用抗生素年龄、父母BMI、妊娠期体质量增加值、父母教育水平、家庭经济水平、母亲妊娠期糖尿病史、妊娠期高血压史、孕前和孕期吸烟史、剖宫产史和父亲吸烟史，其中哮喘由医生报告诊断，患儿有食物、药物、灰尘、化学品等过敏史。
反复下呼吸道感染主要包括肺炎和急性支气管炎，上呼吸道感染主要包括普通感冒、扁桃体炎、鼻窦炎和中耳炎。根据反复呼吸道感染定义[5], 患儿诊断为反复呼吸道感染至少满足以下条件之一: ①每年至少6次上呼吸道或下呼吸道感染发作; ②每年10月到次年2月，每月发生1次或多次呼吸道感染; ③每年至少发生2次下呼吸道感染。
1.3 统计学处理
采用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，计量资料采用(x±s)表示，组间比较采用t检验，计数资料采用[n(%)]表示，行χ2检验比较。采用多因素Logistic回归分析筛选主要危险因素，纳入标准为0.10, 剔除标准为0.05; 采用ROC曲线下面积(AUC)分析预测效能，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 呼吸道感染单因素分析
2 208例学龄前儿童共诊断反复呼吸道感染522例(23.6%), 上呼吸道感染265例(12.0%)和下呼吸道感染397例(18.0%)。年龄≤5岁、母乳喂养时间 < 6个月、初次使用抗生素年龄 < 6个月、母亲妊娠期糖尿病、来自农村、哮喘史、过敏史、睡觉时打鼾的反复呼吸道感染患儿占比高于无呼吸道感染儿童，差异有统计学意义(P < 0.05); 反复呼吸道感染患儿父母BMI值、母亲妊娠期体质量增加值高于无呼吸道感染儿童，差异有统计学意义(P < 0.05)。与无呼吸道感染儿童比较，年龄≤5岁、初次使用抗生素年龄 < 6个月、母亲妊娠期糖尿病、来自农村、哮喘、过敏史、睡觉时打鼾的上呼吸道感染儿童占比较高，差异有统计学意义(P < 0.05); 上呼吸道感染儿童出生BMI值低于无呼吸道感染儿童，父亲BMI值高于无呼吸道感染儿童，差异有统计学意义(P < 0.05)。与无呼吸道感染儿童比较，母乳喂养时间 < 6个月、初次使用抗生素年龄 < 6个月、家庭经济水平 < 20万元人民币/年、妊娠期糖尿病、剖宫产、来自农村、哮喘、过敏史、睡觉时打鼾的下呼吸道感染患儿占比较，差异有统计学意义(P < 0.05); 下呼吸道感染患儿父母BMI值及母亲妊娠期体质量增加值高于无呼吸道感染儿童，差异有统计学意义(P < 0.05)。见表 1。
表 1 呼吸道感染的单因素分析(x±s)[n(%)]因素 反复呼吸道感染 上呼吸道感染 下呼吸道感染 无(n=1 686) 有(n=522) 无(n=1 943) 有(n=265) 无(n=1 811) 有(n=397) 性别 男 977(57.9) 290(55.6) 1119(57.6) 148(55.8) 1044(57.6) 223(56.2) 女 709(42.1) 232(44.4) 824(42.4) 117(44.2) 767(42.4) 174(43.8) 年龄 ≤5岁 900(53.4) 328(62.8)* 1059(54.5) 169(63.8)* 1003(55.4) 225(56.7) >5岁 786(46.6) 194(37.2) 884(45.5) 96(36.2) 808(44.6) 172(43.3) 患儿来源 城市 911(54.0) 235(45.0) 1026(52.8) 120(45.3) 979(54.1) 167(42.1) 农村 775(46.0) 287(55.0)* 917(47.2) 145(54.7)* 832(45.9) 230(57.9)* 出生BMI/(kg/m2) 15.4±1.6 15.3±1.4 15.7±1.8 15.0±1.2* 15.3±1.6 15.3±1.4 出生体质量/kg 3.4±0.3 3.5±0.4 3.3±0.4 3.5±0.5 3.4±0.4 3.4±0.3 母乳喂养时间 < 6个月 250(14.8) 108(20.7)* 315(16.2) 43(16.2) 268(14.8) 90(22.7)* ≥6个月 1436(85.2) 414(79.3) 1628(83.8) 222(83.8) 1543(85.2) 307(77.3) 哮喘史 16(0.9) 26(5.0)* 29(1.5) 13(4.9)* 24(1.3) 18(4.5)* 过敏史 460(27.3) 250(47.9)* 593(30.5) 117(44.2)* 544(30.0) 166(41.8)* 睡觉时打鼾 236(14.0) 101(19.3)* 284(14.6) 53(20.0)* 260(14.4) 77(19.4)* 初次使用抗生素年龄 < 6个月 202(12.0) 99(19.0)* 251(12.9) 50(18.9)* 224(12.4) 77(19.4)* ≥6个月 1484(88.0) 423(91.0) 1692(87.1) 215(81.1) 1587(87.6) 320(80.6) 父亲BMI/(kg/m2) 24.1±1.7 25.4±2.2* 24.2±1.6 25.3±1.9* 24.0±1.8 25.5±2.3* 母亲BMI/(kg/m2) 21.3±1.4 22.1±1.6* 21.7±1.5 21.9±1.8 21.1±1.7 22.4±1.9* 妊娠期体质量增加/kg 14.4±2.5 15.3±2.9* 14.6±2.7 14.7±2.8 14.2±2.1 15.5±3.0* 父亲教育水平 大专及以上 1264(75.0) 391(74.9) 1452(74.7) 200(75.5) 1360(75.1) 295(74.3) 高中及以下 422(25.0) 131(25.1) 491(25.3) 62(24.5) 451(24.9) 102(25.7) 母亲教育水平 大专及以上 1240(73.5) 380(72.8) 1431(73.6) 186(70.2) 1303(71.9) 317(79.8) 高中及以下 446(26.5) 142(27.2) 512(26.4) 76(29.8) 508(28.1) 80(20.2) 家庭经济水平 ≥20万元人民币/年 852(50.5) 281(53.8) 989(50.9) 144(54.3) 971(53.6) 162(40.8) < 20万元人民币/年 834(49.5) 241(46.2) 954(49.1) 121(45.7) 840(46.4) 235(59.2)* 妊娠期糖尿病 152(9.0) 83(15.9)* 195(10.0) 40(15.1)* 167(9.2) 68(17.1)* 妊娠期高血压 52(3.1) 16(3.1) 58(3.0) 10(3.8) 56(3.1) 12(3.0) 孕前吸烟史 30(1.8) 10(1.9) 35(1.8) 5(1.9) 32(1.8) 8(2.0) 孕期吸烟史 9(0.5) 3(0.6) 10(0.5) 2(0.9) 10(0.6) 2(0.5) 父亲吸烟史 741(44.0) 234(44.8) 851(43.8) 124(46.8) 785(43.3) 190(47.9) 剖宫产史 735(43.6) 226(43.3) 845(43.5) 116(43.8) 755(41.7) 206(51.9)* BMI: 体质量指数。与无呼吸道感染儿童比较, *P < 0.05。 2.2 反复呼吸道感染的多因素分析
调整前后Logistic回归分析显示，哮喘、过敏史、初次使用抗生素年龄 < 6个月、母乳喂养时间 < 6个月和母亲BMI值每增加3 kg/m2是反复呼吸道感染和下呼吸道感染的主要危险因素(P < 0.05); 哮喘、过敏史、初次使用抗生素年龄 < 6个月和母亲BMI值每增加3 kg/m2是上呼吸道感染的主要危险因素(P < 0.05)。见表 2。
表 2 呼吸道感染的多因素分析因素 反复呼吸道感染 上呼吸道感染 下呼吸道感染 OR 95%CI P OR 95%CI P OR 95%CI P 调整前 哮喘史 7.45 6.65~8.32 < 0.001 4.85 3.65~5.32 < 0.001 8.03 7.65~8.43 < 0.001 过敏史 2.13 1.56~2.75 < 0.001 2.08 1.55~2.65 < 0.001 2.31 1.63~2.65 < 0.001 初次使用抗生素年龄 < 6个月 1.55 1.16~2.03 < 0.001 1.62 1.23~2.06 < 0.001 1.42 1.12~2.03 < 0.001 母乳喂养时间 < 6个月 1.13 1.02~1.65 0.003 1.08 0.56~1.65 0.234 1.30 1.12~1.69 0.001 母亲BMI值每增加3 kg/m2 1.02 1.00~1.36 0.009 1.03 1.00~1.36 0.016 1.06 1.00~1.63 0.007 妊娠期体质量增加 1.01 0.56~1.54 0.063 1.04 0.45~1.63 0.639 1.08 0.53~1.95 0.098 调整性别、年龄和地区后 哮喘史 8.42 8.01~9.32 < 0.001 5.63 4.67~6.03 < 0.001 7.89 6.69~8.42 < 0.001 过敏史 2.29 1.65~2.75 < 0.001 2.18 1.69~2.75 < 0.001 2.33 1.63~2.98 < 0.001 初次使用抗生素年龄 < 6个月 1.65 1.23~2.03 < 0.001 1.69 1.23~2.12 < 0.001 1.54 1.12~2.34 < 0.001 母乳喂养时间 < 6个月 1.30 1.12~1.76 0.001 1.24 0.63~1.89 0.097 1.42 1.16~2.63 < 0.001 母亲BMI值每增加3 kg/m2 1.13 1.02~1.56 0.003 1.19 1.03~1.59 0.001 1.09 1.00~1.49 0.008 妊娠期体质量增加 1.02 0.36~1.45 0.432 1.05 0.32~1.85 0.639 1.08 0.23~1.54 0.302 2.3 列线图预测模型
根据筛选主要危险因素权重进行赋值，分别建立反复呼吸道感染、上呼吸道感染和下呼吸道感染的列线图模型，见图 1。
2.4 列线图预测效能
ROC分析显示，列线图预测反复呼吸道感染、上呼吸道感染和下呼吸道感染的AUC值分别为0.865、0.833和0.841(P < 0.05)。见表 3、图 2。
表 3 列线图模型预测效能感染 AUC 95%CI P 敏感度/% 特异度/% 反复呼吸道感染 0.865 0.812~0.963 0.006 79.8 72.3 上呼吸道感染 0.833 0.801~0.866 0.012 70.5 65.6 下呼吸道感染 0.841 0.806~0.878 0.009 74.2 68.3 3. 讨论
目前，中国学龄前儿童反复呼吸道感染多高发于冬春季节，需要使用支持性护理服务或抗生素，护士不仅需要肩负救治疾病的责任，同时需要向儿童和监护人进行科学的健康教育，对呼吸道感染高危儿童建立信息档案，以提供科学的预防管理服务，从而减轻医疗压力，降低反复呼吸道感染的发生率[6]。
本研究显示, 2208例学龄前儿童反复呼吸道感染发病率为23.6%, 上呼吸道感染率为12.0%, 下呼吸道感染率为18.0%, 学龄前儿童感染主要集中于上幼儿园的儿童，因此加强幼儿园环境管理和园区教师医疗常识培训十分重要[7]。造成反复呼吸道感染和上下呼吸道感染均包括母乳喂养时间短于6个月、初次使用抗生素年龄 < 6个月、哮喘史、过敏史等因素[8-9]。哮喘是反复肺炎最常见的症状，反复肺炎是儿科常见的急性下呼吸道感染疾病，但哮喘很少出现在复发性肺炎中，其中的因果关系不清楚[10-11]。过敏儿童的上下呼吸道感染率高于无过敏儿童，持续时间长于无过敏儿童。过敏的特点是免疫诱导辅助性T细胞2型(Th2)淋巴细胞激活，减少Th1反应[12]。多个细胞因子如干扰素-γ在过敏性儿童中表达降低，可能是过敏性反复呼吸道感染的一个重要原因[13]。此外，过敏性黏膜炎症可触发上皮细胞上多个黏附分子的表达，如细胞间黏附分子-1是鼻病毒的重要受体，可能导致上呼吸道感染[14]。白细胞介素-13是过敏反应中的一种重要细胞因子，能降低黏液纤毛的清除率，促进病毒与气道上皮细胞的黏附[15]。母乳喂养具有重要保护作用，母乳中含有多种保护因子，如免疫球蛋白、乳铁蛋白和淋巴细胞，有助于提高儿童防御疾病的能力[16], 但母乳喂养可能会导致母亲肥胖，母亲肥胖是复发性难治性消化道疾病的重要危险因素，母亲BMI增加可能对胎儿的生长、发育产生一定影响[17]。约4/5儿童6岁前多次使用抗生素治疗呼吸道感染，其中首次使用抗生素 < 6个月与反复呼吸道感染的风险增高密切相关[18], 原因可能为抗生素导致出生后儿童的肠道细菌多样性改变和机体免疫调节能力下降，影响Th和淋巴细胞性T细胞的动态平衡，肠道微生物群在新生儿免疫系统的成熟过程中起关键作用，导致呼吸系统疾病的发展和肠道感染[19]。早期应用抗生素的儿童由于感染导致Th1/Th2失衡，使其更容易受到呼吸道感染的影响。抗生素相关的炎症反应可能导致Th2移位、免疫反应增强或早期Th1免疫反应受损[20]。本研究显示，列线图预测反复呼吸道感染、上呼吸道感染和下呼吸道感染的准确性分别为0.865、0.833和0.841(P < 0.05), 提示建立列线图模型对指导临床识别反复呼吸道感染高危儿童具有较好的指导作用。
综上所述，学龄前儿童有较高的反复呼吸道感染发生率，哮喘、过敏史、初次使用抗生素年龄 < 6个月、母乳喂养时间 < 6个月和母亲BMI值每增加3 kg/m2是呼吸道感染和下呼吸道感染的主要危险因素。建立定量列线图模型可以较好指导临床早期识别高危儿童，并进行早期干预。
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图 1 各组肺组织形态学改变及巨噬细胞浸润情况
A: 3组HE染色、CD68染色、Masson染色图(放大倍数200倍); B: 3组相对炎性细胞评分; C: 3组相对上皮基底膜厚度。与对照组比较, *P＜0.05; 与模型组比较, #P＜0.05。
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图 4 各组炎症因子表达情况
A: TNF-α表达情况; B: IFN-γ表达情况; C: IL-5表达情况; D: IL-13表达情况。与对照组比较, *P＜0.05; 与模型组比较, #P＜0.05。
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图 5 各组细胞焦亡情况检测
A: 免疫组化检测NLRP3(放大倍数200倍); B: NLRP3、Caspase-1、IL-1B免疫印迹条带; C: NLRP3、Caspase-1、IL-1B表达水平量化。与对照组比较, *P＜0.05; 与模型组比较, #P＜0.05。
表 1 各处理组炎症因子表达情况(x±s)
pg/mL 炎症因子 对照组 模型组 治疗组 肿瘤坏死因子-α 4.38±1.62 60.45±5.09 18.40±3.14* 干扰素-γ 2.16±0.81 26.56±3.53 9.20±3.74* 白细胞介素-5 12.29±4.01 59.24±13.63 16.39±6.13* 白细胞介素-13 2.79±1.93 16.26±2.43 11.87±2.97* 与模型组比较, *P＜0.05。 
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