Influence of long non-coding RNA KCNQ1 overlapping transcript 1 on cellular proliferation, migration and invasive ability of lung squamous cell carcinoma
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摘要:目的 检测长链非编码RNA(lncRNA) KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)在肺鳞癌组织中的表达及其对肺鳞癌NCI-H266细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法 采用实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测KCNQ1OT1基因在肺鳞癌组织中的表达。构建KCNQ1OT1基因的小干扰RNA(siRNA-KCNQ1OT1)并转染NCI-H266细胞, RT-PCR检测转染效果; MTT法检测NCI-H266细胞的增殖活力; 划痕实验检测NCI-H266细胞的迁移能力; Transwell小室检测NCI-H266细胞的侵袭能力。结果 KCNQ1OT1基因在肺鳞癌组织中呈显著高表达(P < 0.05), KCNQ1OT1的高表达与肺鳞癌分化程度、肿瘤体积、淋巴结转移以及TNM分期相关。si-KCNQ1OT1的转染能够显著下调NCI-H266细胞中KCNQ1OT1的表达(P < 0.05), 沉默KCNQ1OT1能够显著抑制NCI-H266细胞的增殖活力、迁移能力、侵袭能力(P < 0.05)。结论 KCNQ1OT1基因的表达上调与肺鳞癌的发生、发展相关，沉默KCNQ1OT1能够显著抑制NCI-H266细胞的增殖以及迁移和侵袭能力。Abstract:Objective To detect the expression of long non-coding RNA (lncRNA) KCNQ1 overlapping transcript 1 (KCNQ1OT1) in tissues of lung squamous cell carcinoma and to explore the influence of KCNQ1OT1 gene on cellular proliferation, migration and invasive ability of NCI-H266 cells.Methods Real-time PCR (RT-PCR) was used to detect the expression of KCNQ1OT1 gene in the tissues of lung squamous cell carcinoma. Small interfering RNA (siRNA-KCNQ1OT1) of KCNQ1OT1 gene was constructed to transfect the NCI-H266 cells, and RT-PCR was used to detect transfection effect. MTT was used to detect cellular proliferation of the NCI-H266 cells, scarification test was used to detect migration ability of the NCI-H266 cells, and the invasive ability of NCI-H266 cells was detected in Transwell cells.Results KCNQ1OT1 gene was significantly over-expressed in lung squamous cell carcinoma (P < 0.05). The over-expression of KCNQ1OT1 was correlated with differentiation, tumor volume, lymph node metastasis and TNM stage of lung squamous cell carcinoma. The expression of KCNQ1OT1 in NCI-H266 cells was significantly down-regulated by transfection of si-KCNQ1OT1 (P < 0.05). Silencing KCNQ1OT1 was able to significantly inhibit the proliferation, migration and invasion of NCI-H266 cells (P < 0.05).Conclusion Up-regulation of KCNQ1OT1 gene expression is associated with the occurrence and development of lung squamous cell carcinoma. Silencing KCNQ1OT1 can significantly inhibit the proliferation, migration and invasion of NCI-H266 cells.
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目前，肺癌已成为全球发病率最高的恶性肿瘤。近20年来，中国肺癌已然成为癌症患者死亡的首要病因，呈现高发病率、高病死率、年轻化的趋势[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)为肺癌高发疾病类型，临床一经确诊，往往已属中晚期，且已不具备外科手术指征，尤其是老年患者，常常合并多种基础疾病，机体免疫功能、脏器代谢机能日渐衰退，难以耐受单纯放化疗。因此，临床实践中极需要一种更为安全有效的治疗方法。中医学认为，晚期肺癌脏腑功能紊乱的主要矛盾为脾肾亏虚，本虚标实。临床诊治强调整体观念与阴阳平衡，施治遵循辨证论治与扶正祛邪，通过多靶点、多系统、多脏器调节，调动机体的抗病驱邪能力，恢复机体正常的阴阳平衡，达到抗肿瘤的治疗效果[2]。因此，中西医结合治疗晚期非小细胞肺癌的关键在于化疗的同时，针对正虚邪实及化疗不良反应给予健脾益肾治疗，攻补兼施。本研究采取健脾益肾汤联合化疗治疗晚期非小细胞肺癌，取得了较为满意的效果，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究抽调医院2017年5月—2018年6月收治的108例晚期非小细胞肺癌(NSCLC)进行研究。纳入标准: 符合《中国常见恶性肿瘤诊治规范》[3]; 经病理学、细胞学、CT及磁共振等影像学检查病情确诊为Ⅲ~Ⅳ期NSCLC, 全部病例经肿瘤基因检测均未见基因突变; Karnofsky功能状态(KPS)评分≥60分，生存期超过3个月; 符合中医辩证脾肾两虚证; 近1个月内未接受抗肿瘤治疗，无中药治疗。排除标准: 意识模糊、精神障碍; 存在严重感染; 对本次研究用药过敏者; 依从性不良者; 药物过敏者。
按照1∶1比例配对原则分为2组，其中对照组54例，男30例，女24例; 年龄40~75岁，平均(58.80±7.45)岁; 病理类型: 腺癌30例，鳞癌24例，低分化癌2例，大细胞癌4例。观察组54例，男36例，女18例; 年龄42~76岁，平均(58.76±7.49)岁; 病理类型: 腺癌28例，鳞癌20例，低分化癌3例，大细胞癌3例。2组基本资料数据差异无统计学意义(P>0.05), 可进行后期研究。
1.2 方法
对照组单用化疗治疗，应用多西紫杉醇(四川协力制药有限公司，国药准字H20103662) 75 mg/m2, 与0.9%氯化钠注射液500 mL均匀混合，静脉滴注180 min。第1天; 顺铂(广东岭南制药有限公司，国药准字H20183341) 75 mg/m2静脉滴注，化疗前常规用药预防消化道与过敏反应，一个周期21 d, 连续治疗2个周期。
观察组在化疗治疗基础上联合健脾益肾汤治疗。方药组成: 枸杞20 g、薏苡仁20 g、黄芪40 g、女贞子15 g、炒白术15 g、西洋参(另煎)15 g, 鸡内金10 g、补骨脂10 g、山茱萸10 g。用法用量: 于化疗后第3天开始，每日1剂，每剂煎煮取药液400 mL, 分早晚2次服用。治疗15 d为1个周期，连续治疗2个周期。
1.3 观察指标
① 对比2组中医症候疗效。根据《中药新药临床研究指导原则(试行)》[4]关于中医症候疗效判定，观察治疗前后的腰膝酸软、神疲乏力、胃纳少馨3个主症以及夜尿频多、头晕目眩等3个次症变化，按照无、轻、中、重4个等级划分，对应0、1、2、3分，单项分数总和为总分，评分越高则症状越严重，计算治疗前后的积分差评价症状改善率。症状疗效判定标准如下。显著改善: 症状积分改善超过70%; 改善: 症状积分改善率为30%~69%; 无效: 治疗前后症状积分无变化，或积分改善率<30%。总有效率为显著改善率与改善率之和。②比较2组患者KPS评分改善情况。根据KPS评分标准[5]进行评分，治疗前后分别记录1次，相较于治疗前评分增加>10分为改善; 增加或减少<10分为稳定; 减分>10分为下降。总有效率为改善率与稳定率之和。③对比2组免疫功能变化。分别于治疗前后检测T淋巴细胞亚群，经肝素抗凝全血经细胞仪分析检验，并经软件统计CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表达水平。④评价2组患者治疗后毒副反应。根据抗肿瘤急性、亚急性反应分度标准，从轻到重分为0度、1度、2度、3度、4度。
1.4 统计学分析
应用SPSS 20.0分析统计数据，计数资料用[n(%)]描述分析，行卡方检验分析；计量资料用方差表示，行t检验；以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组中医症状症候比较
观察组治疗总有效率为92.59%, 对照组治疗总有效率为74.07%, 观察组治疗总有效率显著优于对照组(P < 0.05), 见表 1。
表 1 2组中医症候疗效对比[n(%)]组别 n 显著改善 改善 无效 总有效 对照组 54 15(27.78) 25(46.29) 14(25.93) 40(74.07) 观察组 54 22(40.74) 28(51.85) 4(7.41) 50(92.59)* 与对照组比较, *P < 0.05。 2.2 2组患者生存质量比较
观察组KPS评分改善有效率高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 2。
表 2 2组患者的生存质量对比[n(%)]组别 n 改善 稳定 下降 总有效 对照组 54 9(16.67) 23(42.59) 22(40.74) 32(59.26) 观察组 54 16(29.63) 31(57.41) 7(12.96) 47(87.04)* 与对照组比较, *P < 0.05。 2.3 2组治疗前后的免疫功能指标变化比较
对照组治疗后的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+下降、CD8+增加(P < 0.05); 观察组治疗后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高、CD8+下降(P < 0.05); 观察组治疗后的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高于对照组(P < 0.05), CD8+低于对照组(P < 0.05), 见表 3。
表 3 2组治疗前后免疫功能指标变化(x±s)组别 时点 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+ 对照组(n=54) 治疗前 53.75±3.96 35.72±3.55 31.95±3.10 1.22±0.14 治疗后 50.22±3.85* 33.26±3.17* 36.44±3.48* 0.90±0.17* 观察组(n=54) 治疗前 54.35±4.60 36.44±3.22 32.85±3.50 1.23±0.14 治疗后 62.22±5.40*# 40.52±4.12*# 28.62±3.00*# 1.45±0.16*# 与治疗前相比, *P < 0.05; 与对照组相比, #P < 0.05。 2.4 毒副反应比较
观察组白细胞下降、血小板下降、恶心呕吐毒副反应发生率低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 见表 4。
表 4 2组毒副反应对比[n(%)]组别 毒副反应 0度 1度 2度 3度 4度 对照组 白细胞下降 20(37.04) 9(16.67) 13(24.07) 5(9.26) 7(12.96) 血小板下降 42(77.78) 3(5.56) 4(7.41) 5(9.26) 0 恶心、呕吐 29(53.70) 5(9.26) 13(24.07) 5(9.26) 2(3.70) 观察组 白细胞下降 50(92.59) 1(1.85) 2(3.70) 0 1(1.85) 血小板下降 52(96.30) 1(1.85) 1(1.85) 0 0 恶心、呕吐 51(94.44) 2(3.70) 0 1(1.85) 0 3. 讨论
当前，临床治疗肿瘤基因检测阴性的晚期非小细胞肺癌的主要方法为化疗，放化疗方案为最常用化疗治疗方法之一，但单纯化疗治疗效果不佳。有研究[5]表明，联合化疗的总有效率仅为30%左右，而且多数抗肿瘤药物缺乏目标肿瘤选择性作用，因此抑制肿瘤生长同时，会不同程度影响中枢神经系统、机体正常组织细胞等，主要表现为免疫功能削弱、肝肾及神经毒性、消化道反应、骨髓造血功能抑制等，最终导致多数患者难以耐受化疗，或明显影响患者的生活质量水平。针对化疗治疗存在的不足，临床提出在晚期非小细胞肺癌化疗的同时，结合中医药治疗，以期达到扶正祛邪、降低化疗药物毒副作用及由此导致的不良反应，进一步提高患者的临床疗效，延长生存周期。
肺癌属于中医“咳血”、“肺积”、“咳嗽”等范畴，分析其发病机制是正气亏虚、气机不畅、肺气郁闭、气滞血瘀、脉络瘀阻、痰湿瘀毒阻塞，长期如此便会形成肺部肿瘤[7-8]。脾肾亏虚是晚期肺癌的主要症候类型，因此治疗时应强调改善患者的脾肾功能，以健脾益肾为主治疗[9-10]。该方剂中，西洋参为君药，具有清肺火、养阴补气、益胃等功效。补骨脂、黄芪为臣药，具有补肾、益气、健脾的功效，辅以山萸肉、枸杞子、女贞子、鸡内金、薏苡仁以及炒白术等药物，发挥阴阳并重，气血兼顾，标本同治效果，多种药物共同作用，可发挥扶正抗癌、健脾益肾的功效[11-13]。现代药理学研究[14-16]表明，薏苡仁、女贞子、西洋参等药物具有增强食欲食量，促进血清蛋白合成，提高机体免疫力及抗肿瘤细胞增殖活性的功效; 黄芪具有抑制机体氧化损伤作用; 枸杞多糖可改善肿瘤微循环免疫状态，促肿瘤生长; 山茱萸可促巨噬细胞吞噬功能发挥; 补骨脂提取物补骨脂素具有抑制癌症细胞MCF-7的效果。经研究表明，观察组中西医联合用药治疗后中医症候疗效以及生活质量改善疗效优于对照组，而且毒副反应低于对照组，表明中西医结合治疗安全有效。
恶性肿瘤中晚期患者表现为机体免疫力低下，研究表明，肿瘤发展预后与免疫功能相关，因此可通过观察评估免疫机制，评估患者的预后效果。细胞免疫为抗肿瘤免疫的主要内容，与体液免疫发挥协同作用。机体血液T细胞亚群发挥免疫功能, CD3+T细胞为T细胞总量, CD4+具有直接杀伤肿瘤细胞与免疫记忆力的功能, CD8+为抑制性T细胞，两者之间相互制约、相互协调，共同发挥免疫应答调节作用[17-18]。CD4+/CD8+比值动态平衡可保持细胞免疫功能稳定，其比值下降则表明免疫功能下降。本次研究表明，观察组治疗后的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高于对照组，表明中西医联合用药可有效改善机体免疫功能。
综上所述，中西医结合治疗晚期非小细胞肺癌，既可有效减轻患者病痛，改善机体免疫状况，提高患者生存质量，减少单纯化疗治疗后药物毒副反应。
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图 2 沉默KCNQ1OT1基因对NCI-H266细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响
Control表示空白对照组, si-NC表示转染si-NC的NCI-H266细胞, si-KCNQ1OT1表示转染si-KCNQ1OT1的NCI-H266细胞。A: 转染si-KCNQ1OT1显著降低NCI-H266细胞中KCNQ1OT1表达，且与control、si-NC比较, *P < 0.05; B: MTT法检测KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞的增殖活力，且与control、si-NC比较, *P < 0.05; C: KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞迁移能力; D: Transwell法检测KCNQ1OT1表达沉默能抑制NCI-H266细胞的侵袭能力，且与control、si-NC比较, *P < 0.05。
表 1 KCNQ1OT表达与肺鳞癌患者临床病理参数的相关性分析(x±s)
病理参数 n KCNQ1OT表达量 性别 男 28 4.112±1.458 女 23 3.511±1.412 年龄/岁 ≤60 29 3.225±1.513 >60 22 3.783±1.131 肿瘤大小/cm ≤5 34 3.218±1.278** >5 17 4.879±1.129 分化程度 高、中 36 3.115±1.248** 低 15 4.561±1.356 TNM分期 Ⅰ+Ⅱ 37 2.913±0.655** Ⅲ+Ⅳ 14 5.058±1.512 淋巴转移 阴性 30 2.671±0.812** 阳性 21 4.946±1.283 与同一参数另一亚项比较, **P < 0.01。 
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